体内药物分析中的现代分析方法与技术

体内药物分析中的现代分析方法与技术药学院药物分析教研室【大纲要求】了解手性药物的高效液相色谱法、柱切换高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、气相色谱-质谱联用技术、液相色谱-质谱联用技术和毛细管电泳免疫分析的基础知识和主要仪器装置。常见的生物样本WholebloodPlasmaSerumBodytissueSalivaUrinePharmacokineticsConcentrationinbloodMetabolismBioequivalenceHPLCChiralHPLCColumnswitchingHPLCMultipledimentionalHPLCHPCEGC/MSLC/MSLC/MS/MSLC/NMR手性高效液相色谱法柱切换高效液相色谱法高效毛细管电泳气相色谱－质谱联用技术液相色谱－质谱联用技术OCH3FHHHOHCH3OHOHONCH3CH3HHO手性高效液相色谱法◆◆◆◆药理活性上的相互协同作用药理活性上的没有影响药理活性上的相互拮抗体内过程中的代谢差异ChiralHPLCPre-columnderivationChiralmobilephaseadditivesCMPAChiralsolidphaseCSP目的：以现代色谱分离技术为基础，引入手性环境，使药物对应体间呈现理化特性的差异，从而实现药物对应体的色谱分离。Indirecttechnique：是药物对应体在进行分离前，先与具有高光学程度的手性衍生化试剂（CDR）反应，引入另一手性中心，形成非对应异构体，再进行常规HPLC分离。Chiralderivationreagent,CDR◆◆◆◆CDR必须是高光学纯度，并且应具有较好的UVorFD，并需要较好的稳定性Derivation必须定量完成Activegroup-NH2、-OH、-COOH、-SH和较好的稳定性衍生化生成的非对应异构体在分离是应具有较高的柱效N1、ITC(酸酯）和IC（异氰酸酯）类：苯乙基异氰酸酯（PEIC）、萘乙基异氰酸酯（NEIC）、GITC（乙酰葡萄糖异硫酸酯）2、萘衍生物3、羧酸衍生物4、胺类常用衍生化试剂的种类时间(min)605856545250484644424038363432302826242220181614121086420电压(mv)300280260240220200180160140120100806040200GITCHNCH3CH3HOHOHOHNCH3CH3HOHOHOHGITCONHHOHCH3CH3ONHOHC3H7OH3CCOOCCH3NHOCCH3OOOOCCH3OCSOH3CCOOCCH3NHOCCH3OOOOCCH3OCHS0200400600800100012000510152025Time(h)Concentration(ng/ml)HCH3NHCH3NOCF3ClOTFAPCmethamphetamineHCH3NNOCF3OH3C缺点优点高光学纯度对应体的反应速度不同反应繁琐费时价格便宜柱效高可提高检测灵敏度衍生化同时伴随样品纯化Directtechnique：是在HPLC系统中引入“手性识别器”或手性环境，以形成暂时的非对应异构体复合物，根据所形成复合物的稳定常数不同而得以分离。手性流动相法手性固定相法ChiralmobilephaseadditivesCMPAChiralsolidphaseCSP手性流动相法环糊精类手性添加剂CyclodextrinCD手性离子对试剂配基交换型手性添加剂在流动相中加入手性添加剂（CMPA），使其与待测药物形成非对映异构体复合物，根据复合物的稳定常数不同而分离。Optimizedconditions：CMPAConcentrationmobilephasepHflowrateHNHOHOHOHβ-CD.Optimizedanalyticalconditions:Column:C18Hypersil(150×4.6mm,I.D.,5μm;Mobilephase:methanol-water-HAC(40:60:0.5);Flowrate:1.0ml/min;Columntemperature:25℃;ConcentrationofCD:10.0mmol/l.缺点优点可拆分的化合物有限稳定性差，干扰大用量大，费用高不需要柱前衍生化不需要昂贵的手性柱、简便非对应异构化，络合反应具有可逆性ChiralsolidphaseCSP是在色谱柱的担体上加上高光学纯度的手性异构体，根据CSP的化学性质的不同而分离电荷转移型手性固定相蛋白质类手性固定相多糖及其衍生物类手性固定相环糊精类手性固定相冠醚类手性固定相小分子和大分子型电荷转移型手性固定相：π碱型Pirkle手性固定相π酸型Pirkle手性固定相蛋白质类手性固定相：α1-酸性糖蛋白柱（α1-AGP）人血清白蛋白柱（HAS）多糖及其衍生物类手性固定相：ChiralcelOD柱ChiralcelOJ柱环糊精类手性固定相：β-CD柱γ-CD柱NOHOHSOCaptoprilβ-CD柱缺点优点有时需要进行柱前衍生化适应性差CSP柱昂贵，费用高适用于不含活波反应基团的化合物无需高纯度的CDR样品处理简单、制备分离方便应用广泛定量准确度高An60μlaliquotofthesupernatantwasdirectlyinjectedintothesameHPLCsystemfittedwithachiralstationaryphasecolumn(ChiralcelOJ-H,250mm×4.6mm,5m),protectedbyaguardcolumn(10mm×4mm)packedwiththesamepackingmaterial(DaicelChemicals,Japan).Prof.JohnCaldwellFacultyofMedicineUniversityofLiverpoolDuncanBuildingDaulbyStreetLiverpoolL693GA,UnitedKingdomE-mail:[e-mail]=2.165=3.638第二部分：SwitchingcolumnHPLCMultiplecolumnchromatographyCoupledcolumnchromatographySplitchromatographyMultipledimentionalchromatographyOn-linechromatographyLC×LCsystemPlasmaExtractedsolutionLLEorPPISaddedDrynessN2orAirMobilephase/methanolorCH3CNSolutionHPLCanalysis定义：是指那些能够由阀来改变流动相的走向与流动相系统，从而使洗脱液在某一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。◆◆◆◆在线净化样品，前处理自动化富集微量组分同时分离多个目标组分在线衍生化，提高检测灵敏度◆提高色谱性能柱切换目的◆Directinjectionafterproteinprecipitation◆On-lineremoveproteinanddirectinjectionofplasmaorserum◆DirectinjectionofwholebloodorbodytissueMainseparationandanalysismodeDirectinjectionafterproteinprecipitation操作：在生物样品中加入适当的蛋白沉淀剂，将上清液大容量直接进入预处理柱，选用合适的流动相，使被测组分在预柱上保留，而杂质被洗脱，从而净化样品，在使用另一溶剂系统将目标化合物解析进入分析柱分析。注意事项：1、如采用甲醇或乙腈沉淀蛋白，需要用适当体积的水稀释样品，防止被测组分在净化时被洗脱。2、尽量使净化和分析用的流动相接近，避免柱切换后产生干扰样品分析的系统峰。3、采用洗脱能力高于预处理流动相的分析流动相，或“反冲”，并使预注与分析柱的填料性质相同来避免色谱峰的扩宽On-lineremoveproteinanddirectinjectionofplasmaorserum操作：在以水为主的预处理流动相的引导下，将大体积的体液样品直接进入预处理柱，在水的冲洗下除去蛋白质和极性内源性物质，被测组分保留在预柱上，然后柱切换，用分析流动相将被测组分从预处理柱冲洗至分析柱，进行分析测定。注意事项：1、预处理柱应使用颗粒较粗的填料，使用一段时间后应进行再生处理。2、对于高蛋白结合率的药物，要提高样品回收率，可采用调节预处理流动相的pH值或降低进样时预处理流动相的流速。3、被测组分从预处理柱进入分析柱的时间应最小。Directinjectionofwholebloodorbodytissue操作：使用粗粒径的固相填料和较大的柱滤板，以水为冲洗液去除血细胞及蛋白质，后用适当的溶液净化，再以分析流动相冲洗被测组分至分析柱进行分析。柱切换与其他技术的联用1、在线透析（On-linedialysis)2、在线衍生化(On-linederivation)Pre-columnderivationPost-columnderivationONH3COH3COLC-LCsystemNFOHOHCOONaFluvastatinBlankplasmaPlasmaspikedwithstandardPlasmaobtainedafteroraladministrationHigh-performancecapillaryelectrophoresisHPCE是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术。电泳electrophoresis是指溶液中带电粒子在电场作用下发生迁移的电动现象。毛细管电泳capillaryelectrophoresis是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。特点瑞典化学家Tiselius建立了“移界电泳”，成功地将人血清中的蛋白质分为5个主要成分，为蛋白质化学的发展奠定了基础。诺贝尔奖优点:操作简单，试样量少，分离效率高，成本低等。在迁移时间上的重现性，进样的准确性和检测灵敏度方面比高效液相色谱法稍逊。毛细管电泳的基本原理电泳分离的基础=eE为离子移动的速度e为电泳迁移率E为毛细管柱进样端至检测窗口间电场强度。离子的电泳迁移率不同，在电场中移动的速度不一样，利用这个原理可以把不同的离子彼此分离。电泳迁移率与分析物质所带电荷呈正比，与摩擦阻力系数呈反比。如果两种物质带有不同的电荷或者通过缓冲溶液移动的摩擦力不同，那么这两种物质可以彼此分离。电荷-尺寸毛细管电泳1离子移动的速率=eE=eU/LU是毛细管柱两端施加的压力L是毛细管柱总长。采用高电压可以达到使离子迅速移动和快速分离。2毛细管电泳中的板高N=eU/2D由于分离度随塔板数的增加而增加，因此为了获得高的分离度应采用高电压。在凝胶板形电泳中，一般最高使用的电压约为500V。在毛细管电泳中，一般可采用20,000～60,000V的高电压。3电渗流在电泳过程中还存在另一种电动现象，即电渗。当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，管内的溶质向阴极或阳极移动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。在典型的毛细管电泳分离中，若有电渗存在，离子的洗脱顺序是:首先是最快的阳离子，紧接着是依次减慢的阳离子，然后是全部的中性分子在一个区域出现，最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快的阴离子。基本构造■■■高压直流电源分离通道－毛细管检测器■缓冲液贮存瓶毛细管电泳装置