WB检测磷酸化蛋白的实验方案

WB检测磷酸化蛋白的实验方案请关注：↑Abcam 助您更快实现研究使命将细胞或组织样品在裂解缓冲液中匀浆，裂解缓冲液需新鲜制备，加入蛋白酶抑制剂（检测磷酸化蛋白时还应加入磷酸酶抑制剂）。一旦开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。始终将样品置于冰上或维持在4°C，并在一开始就向裂解缓冲液中新鲜加入合适的抑制剂，能够显著减缓这些反应。使用加入了新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA或NP40缓冲液。实验步骤1.向含有1-100ng靶蛋白（500µg裂解物）的蛋白样品中加入等体积的2xSDS-PAGE样品缓冲液。对于还原样品，样品缓冲液中应该同时加入DTT或β-巯基乙醇。对于非还原样品，不加入DTT或β-巯基乙醇。2.将样品加热到95°C或煮沸5分钟，使蛋白变性。3.上样并在标准条件下跑胶。4.通过半干法或湿法将蛋白转印至PVDF膜上。请注意：PVDF膜必须预先在甲醇溶液中湿润后。5.如有需要，可以在丽春红染料中对膜进行简单地（10秒）染色，以确定转膜效率。可以用PBST或TBST清洗去除染料。我们不建议在蒸馏水中清洗，因为某些情况下可能会使蛋白质脱落下来。6.在TBST中加入5%w/vBSA对膜进行封闭。在摇床上4°C孵育1小时。7.使用TBST稀释一抗至建议稀释度。我们推荐在封闭的袋子、杂交管或50mLFalcon管（约2.5mL缓冲液）中进行孵育。在摇床上4°C孵育过夜。8.室温下使用TBST洗膜3至4次，每次5分钟。9.在TBST中，按照建议的稀释度（虽然需要对特定应用进行优化，1/5000是较好的通用工作稀释度）稀释HRP二抗。10.室温下使用TBST洗膜3至4次，每次5分钟。11.进行ECLPlus检测。注意事项abcam2018-10-17abcam此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。阅读原文1.使蛋白保持在磷酸化的状态！加入充足的磷酸酶抑制剂，并始终将样品置于冰上。2.使用 5%w/vBSA(fractionV) 而非牛奶（牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白；而抗体会检测牛奶中的酪蛋白导致高背景）封闭膜。3.请记住磷酸化可能需要被诱导。信号弱或无信号可能意味着诱导不充分。建议使用推荐的阳性对照。4.研究磷酸化时，请记得向裂解液中加入磷酸酶抑制剂点击阅读原文，可查看英文原版实验方案◤此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。