第九讲-头孢菌素类

头孢菌素CCephalosporinC头孢菌素C1头孢菌素C概述2头孢菌素C的生物合成3菌种选育与保存4发酵过程优化5头孢菌素C的分离纯化工艺67-ACA的酶法制备与直接发酵生产1头孢菌素C概述头孢菌素C是由Newton和Abraham于1953年继青霉素之后，在自然界中发现的第二种类型的β-内酰胺类抗生素。头孢菌素C与青霉素有许多共同特征，抗菌作用机制也是抑制细菌细胞壁肽的合成，对人体安全无毒。头孢菌素C的化学结构ONSHHCOOHCH2OCOCH3HOOCCH(CH2)3NH2CONHHHCOOHCH2OCOCH3ONSH2NCephalosporinC7-ACA1961年证实了头孢菌素C的化学结构1237头孢菌素C概述(2)头孢菌素C抗菌活性低，受半合成青霉素启示，通过结构改造获得了很多更有效的半合成头孢菌素，因此头孢菌素C是目前各种半合成头孢菌素的起始原料之一。在温和的条件下，用酸水解头孢菌素C可得除去侧链的母核，即7-氨基头孢霉烷酸（7-ACA）。头孢菌素C概述(3)经酸水解或乙酰酯酶处理头孢菌素C，则生成去乙酰头孢菌素C（简称DCPC，3位-CH2OH）。用钯碳及氢使头孢菌素C氢化可得到去乙酰氧头孢菌素C（DOCPC或7-ADCA，3位-CH3）。2头孢菌素C生物合成前体氨基酸的生物合成头孢菌素C的生物合成头孢菌素C的结构α-氨基已二酸半胱氨酸缬氨酸醋酸（侧链）7－氨基头孢烷酸（7－ACA）（母核）ONHHHCOOHNSOOO+_ONH3OCH3α-氨基己二酸前体氨基酸的生物合成α-氨基己二酸（α-AAA）的生物合成（葡萄糖、氨水）缬氨酸（Val）的生物合成（葡萄糖、氨水）半胱氨酸（Gys）的生物合成（葡萄糖、氨水、SO42－）ACV三肽IPN：异青霉素N扩环酶羟化转乙酰化苯乙酰-S-CoA转酰基反应脱乙酰氧头孢菌素C合成酶头孢菌素C的生物合成(1)头孢菌素C也是由α-氨基己二酸(α-AAA),半胱氨酸和缬氨酸经三肽途径生物合成ACV三肽，而且在异青霉素N以前的阶段和青霉素的生物合成完全一样。此后，经顶头孢霉产生的异构酶作用，将异青N（IPN）转化为青霉素N，再由扩环酶（脱乙酰氧头孢菌素C合成酶）催化扩环生成脱乙酰氧头孢菌素C，最后通过羟化和转乙酰基反应得到头孢菌素C。3菌种选育与保存(1)原始亲株：顶头孢霉M8650，全世界所有高产菌差不多都是由它反复诱变、筛选得到的。出发菌株通过诱变在完全培养基上获得蛋氨酸营养缺陷株，然后转入加有各种含硫化合物（如硫酸盐）以代替Met的基本培养基，可筛选出不需要加入Met的高产突变株，从而降低成本。菌种选育与保存(2)原生质体融合也是高产菌株选育的一种有效方法。顶头孢霉的细胞壁对β-葡萄糖苷酸酶敏感，可用Helixpomatia产生的这种酶进行破壁，形成原生质体。聚乙烯醇能促进原生质体的融合和重组细胞的再生。菌种选育与保存(3)由于扩环和羟化是头孢菌素C生物合成途径限速阶段，因此可用现代基因工程技术构建含克隆的扩环/羟化酶基因的质粒，将其转入工业生产菌株中，获得显著提高头孢菌素C生产能力的基因工程菌。菌种选育与保存(4)菌株的保存可以采用冷冻干燥法或液氮法。由于保存的大部分是营养菌丝，长期保存后生命力的恢复较差，故经过保存的菌株应对存活细胞进行计数，并在摇瓶及中试条件下开展能力试验，挑选复壮的菌落作为生产用种子。4发酵过程优化培养基通气搅拌菌丝生长速率菌丝形态发酵终点培养基(1)氮源玉米浆已经被证明是一种优良的氮源，它提供各种丰富的氨基酸、肽、蛋白质和微量元素，起始用量一般为2~6g/L；其它氮源有花生饼粉、硫酸铵、氨、尿素等。当基础培养基中的氮源消耗到一定浓度时，要不断补加氮源（硫酸铵或氨），以维持发酵液中氨氮含量在0.5~0.7g/L之间。补氨还能起到控制pH的作用。培养基(2)碳源可使用葡萄糖、糊精、淀粉或植物油。植物油通常作为流加碳源，而其它碳源加入基础培养基中。添加无机盐以满足菌丝生长对Mg2+、PO43-等的需要，特别是当采用含有有机物少的稀薄培养基时。通气搅拌(1)在头孢菌素C发酵中要求较高的氧传递速率，以维持所需的溶氧浓度。因为三肽的环化、青霉素N的扩环和脱乙酰氧头孢菌素C的羟化都是氧化反应。为了维持所需的溶氧浓度，一般搅拌输入功率为4kW/m3(发酵液)以上。通气搅拌(2)根据溶氧的变化情况，可将发酵过程分为两个阶段。第一阶段是菌丝量高速增长、溶氧迅速下降的生长阶段。这一阶段必须在溶氧成为限制因子之前结束，它可以通过使碳源成为限制因子来达到。通气搅拌(3)在生产的第二阶段，要严格控制油的流加量，使溶氧始终保持在25％饱和度以上。一旦加油过多，可以提高搅拌转速和发酵温度。以加速氧的传递和油的消耗，避免溶氧过分下降。菌丝生长速率实验表明，用豆油作为生长限制基质时，比生长率则与比生产率成正比；比生长率由0.01/h提高到0.04/h，比生产率增加到2倍。因此用葡萄糖碳源可调控菌丝生长率。菌丝形态在头孢菌素C发酵过程中，产生菌顶头孢霉呈现明显的形态。在快速生长期，菌体以细长到丝状为主；随着营养的消耗和比生长率的下降，菌丝开始膨胀、断裂，最后形成单细胞的节孢子。发酵终点（1）头孢菌素C是不稳定的化合物，其发酵终点由产率、产物组成、成本、效益、过滤速度等综合因素来决定。发酵终点（2）头孢菌素C在发酵过程中，一方面分子中的β-内酰胺以5×10-3/h的一级反应速率非酶降解，故随着发酵液中头孢菌素C浓度的提高，绝对降解量逐渐加大。发酵终点（3）另一方面，由于乙酰酯酶的存在，部分头孢菌素C被转化为脱乙酰头孢菌素C，而且它比较稳定，因而占发酵总产物的比例将越来越高。β-内酰胺环降解后的产物及脱乙酰头孢菌素C含量的增加，将对头孢菌素C的回收造成不利的影响。随着发酵时间的延长，由于菌丝形态的变化及自溶，发酵液将变得难以过滤。5头孢菌素C的分离纯化工艺目前工业上主要采用多种分离纯化方法相结合的生产工艺。即先用大孔吸附树脂从发酵液中初步分离出头孢菌素C，然后经离子交换法纯化，最后采用络盐沉淀法进行结晶。头孢菌素C的分离纯化的工艺流程具体工艺流程发酵液预处理发酵液中有头孢菌素C、去乙酰头孢菌素C及微量的去乙酰氧头孢菌素C。用H2SO4酸化至pH2.5~3.0，放置一定时间，使去乙酰头C（DCPC）内酯化而易于和头C分离。大孔吸附树脂的吸附与解吸XAD-4大孔吸附树脂，吸附pH应为2.5~3.0，吸附容量15~20g/L树脂；吸附完毕用2~4倍吸附体积去离子水洗涤，除去SO42－等阴离子，以免干扰后续工序离子交换树脂的纯化；然后用15％~25％乙醇，丙酮或异丙醇水溶液来解吸。离子交换树脂的纯化头孢菌素C分子具有两个羧基和一个氨基，由于氨基碱性较弱，不能用阳离子交换树脂处理，用强碱性阴离子交换树脂吸附虽好，但解吸困难。故采用弱碱性阴离子交换树脂来分离纯化头C。吸附预先用醋酸溶液处理树脂使成醋酸型，再开始吸附。吸附完毕，用去离子水洗涤树脂，然后以1.5％~2.5％的醋酸钠（钾）水溶液解吸。沉淀结晶头C可与二价重金属离子Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Pb2+等形成1:1摩尔比的难溶性络盐微晶沉淀。利用这一原理，在头C二次解吸液中直接进行沉淀结晶。其中以锌盐用得最普遍。分离纯化工艺特点将大孔吸附树脂法、离子交换及沉淀法三者合理地结合起来，扬长避短，使头C的分离纯化在收率与质量上达到较为满意的结果。67-ACA的酶法制备与直接发酵7-ACA的酶法制备7-ACA的直接发酵生产7-ACA的酶法制备（1）7-ACA的酶法制备：7-氨基头孢烯酸（7-ACA）是头孢菌素C的母核，它和6-氨基青霉烷酸（6-APA）一样，都可以通过侧链的改造制成各种各样的半合成β-内酰胺抗生素。所不同的是，6-APA只能在6-位侧链上进行改造，而7-ACA可同时在7-位和3-位上进行化学修饰。7-ACA的酶法制备（2）酶法制备7-ACA的工艺分两步进行，第一步是用可变三角酵母产生的D-氨基酸氧化酶（或用乙醛酸），在Cu2+和吡啶存在下，对头孢菌素C进行脱氨反应（脱去α-AAA的氨基），生成7β-(5-氧-5-羧基戊酰胺基)头孢烯酸（GL-7-ACA）中间体；7-ACA的酶法制备（3）第二步是用假单胞菌产生的GL-7-ACA酰化酶将这一中间体酶解脱去戊二酸，生成7-ACA。第一步反应可直接用头孢菌素C发酵液进行，反应生成的GL-7-ACA需提取和部分精制，才用于第二步反应。GL-7-ACA代表7β-(5-氧-5-羧基戊酰胺基)头孢烯酸7-ACA的酶法制备（4）GL-7-ACA酰化酶可用苯乙烯类阴离子交换树脂作为载体，以戊二醛为交联剂，制成固定化酶，装入反应柱中，采用下图所示的装置。GL-7-ACA代表7β-(5-氧-5-羧基戊酰胺基)头孢烯酸酶法制备7-ACA的反应装置7β-(5-氧-5-羧基戊酰胺基)头孢烯酸7-ACA的酶法制备（5）在温度15~25℃、pH7.5~8.5下进行酰化反应，所得7-ACA收率约为95%。制成的固定化酶可反复使用70次，但每次重复使用时都应适当提高反应温度，以保持和以前大体相同的反应速率。从反应柱排出液中回收的7-ACA可以用等电点结晶精制。7-ACA的直接发酵生产小松和磯贝等分别发现，假单孢菌SE83(PseudomonasSE83)和缺陷假单孢菌(PseudomonasdiminutaV22)能产生将头孢菌素C直接水解生成7-ACA的酰化酶。它们分别将这一酰化酶基因克隆到头孢菌素C产生菌中，使该菌在产生头孢菌素C的同时，将部分头孢菌素C脱酰基生成7-ACA，从而开创了直接发酵生产7-ACA的可能途径。7-ACA的二步酶法和一步酶法生产GL-7-ACA代表7β-(5-氧-5-羧基戊酰胺基)头孢烯酸7β-(5-氧-5-羧基戊酰胺基)头孢烯酸发酵工序示意图THEEND.THANKYOU!