miRNA-的研究策略与方法

miRNA的研究策略与方法GuangzhouGuangzhouRiboBioRiboBioCO.,LtdCO.,Ltd聂忠清聂忠清2010.092010.09主要内容miRNA简介miRNA研究的殊荣1993Lin-4，？miRNA发现者访问锐博Ambros教授同公司董事长张必良等合影Ambros教授听取技术人员对公司miRNA产品介绍miRNA的结构Lauetal.,2001miRNA生成和作用通路Garzonetal，2009miRNA作用简介与siRNA非常类似，直接靶向和切割mRNAmiRNA与靶基因完全互补mRNA切割促进靶mRNA去poly（A）尾，降低mRNA的稳定性，从而促使其降解miRNA与靶基因完全互补mRNA降解在转录水平抑制靶基因的表达（molcel.2010.03）介导靶标基因DNA的甲基化甲基化靶基因不影响mRNA的稳定性,主要在翻译水平进行抑制基因表达，包括翻译起始抑制；阻断翻译延伸；新生肽链的降解等。大多数动物体内的miRNA都是通过翻译抑制的机制发挥作用miRNA与靶基因不完全互补翻译抑制作用效果作用方式作用机制miRNA表达的时空特异性PlasterkRHACell124:8772006miRNA与siRNA的区别每一个mRNA均可设计出siRNA，除非靶位点在同源基因的保守区，否则特异性强。预测30%的基因直接受miRNA调节，单miRNA调控多个靶基因，多个miRNA调控单个靶基因，网络调控近完全抑制蛋白的表达；微调蛋白的表达；降解靶mRNA，尚未发现其他特定结构体的参与；抑制mRNA翻译或者促进mRNA降解，该过程可能有P-body这样的特殊结构参与；与靶mRNA完全互补，单碱基的突变会影响干扰效果；与靶mRNA不完全互补或完全互补都能作用；形成siRISC沉默复合体；形成miRISC沉默复合体；功能无前体形式存在存在初级前体pri-miRNA及前体pre-miRNA无Drosha类蛋白参与加工核内加工过程有Drosha类蛋白的参与成熟过程无特定的siRNA基因；miRNA基因存在与多种物种的基因组中；存在形式siRNAmiRNAmiRNA的功能miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA几乎参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等每一个生命活动的过程。序列分析表明，有1/3以上的人类基因直接受到miRNA的调控，而且越来越多的试验证据表明miRNA还有很多功能未被发现。miRNA具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用，被称作oncogenicmiRNA，即oncomiR。oncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异（包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等）有关。其表达情况与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、预后相关。药物临床：丹麦制药公司SantarisPharma2008年宣布SPC3649(LNA-antimiRTM-122)开始进入人体第一阶段的临床试验。这是世界上首个在人体中试验的microRNA药物。这项研究由哥本哈根PhaseOneTrialsA/S组织管理，最多包含48名健康男性志愿者。公司同时宣布研究的第一批健康志愿者已经圆满的完成了治疗。SPC3649是由SantarisPharma开发的丙型肝炎的新型治疗手段，第二阶段在肝病病人上的试验在2009年开始。肿瘤相关miRNA（初步）结肠直肠癌miR-135b结肠直肠癌miR-133b胶质母细胞瘤miR-128神经母细胞瘤、乳腺癌miR-125a、miR-125b白血病、胰腺癌miR-107胰腺癌miR-103头颈癌miR-98结肠直肠癌miR-96胰腺癌miR-34a结肠直肠癌miR-31白血病，胆管腺癌miR-29、miR-29b乳腺癌、胆管腺癌、头颈癌、白血病、宫颈癌miR-21肺癌、淋巴瘤miR-20a肺癌、淋巴瘤miR-17-5p、miR-17-92白血病、垂体腺瘤miR-16、miR-16-1白血病、垂体腺瘤miR-15、miR-15a乳腺癌miR-10b神经母细胞瘤miR-9肿瘤发生microRNA肺癌、结肠癌let-7、let-7a、let-7a-1、hsa-let-7a-2、let-7a-3胰腺癌miR-376胰腺癌miR-301白血病miR-223甲状腺癌miR-222胶质母细胞瘤、甲状腺癌、胰腺癌miR-221胰腺癌miR-196a-2神经母细胞瘤miR-184直肠结肠癌miR-183肺癌、白血病、胶质母细胞瘤、甲状腺癌miR-181、miR-181a、miR-181b、miR-181c乳腺癌、白血病、胰腺癌miR-155甲状腺癌miR-146乳腺癌、结肠直肠癌miR-145结肠癌、宫颈癌miR-143miRNA相关数据库：Homosapiens[GRCh37](940)Mouse：Musmusculus[NCBIM37](590)Rat：Rattusnorvegicus[RGSC3.4](326)picTar、TargetScan、miRDB等Genomics:miRNA在基因中的位置Targets:联合多个常用预测软件Cluster:指定长度的miRNAcluster综合数据库基因定位、表达CoGemiRMasellietal.,2008://mirdb.org.miRNA靶点预测及miRNA及靶基因功能注释miRDBWang,2008所在的信号通路miRNApathChiromatzoetal.,2007靶位点的多态性PolymiRTSBaoetal.,2007数据收集UTRsouse表达谱SmiRNAdbLandgrafetal.,2007预测，靶点预测，miRNA启动子预测miTools靶点预测及miRNA表达MicroRNA.orgBeteletal.,2008，表达及靶点信息miRNAMapHsuetal.,2006来源，表达，功能Argonaute2Shahietal.,2006收集实验验证的靶点TarBaseSethupathyetal.,2006基因组信息，靶点预测，miRNA簇预测miRGenMegrawetal.,2006序列注册，靶点预测，并提供序列信息miRBaseGriffiths-Jonesetal.,2008网址主要用途名称/参考文献miRNA研究发展趋势—drugmiRNA研究特点miRNA研究流程特点寻找miRNA寻找miRNA靶点miRNA靶点验证验证miRNA与生物表型的关系1.文献报道2.表达谱分析3.功能筛选1.靶点预测：picTar、TargetScan等1.mRNA水平2.蛋白水平3.双报告系统4.生物表型1.细胞水平2.模型动物水平3.人体组织样本4.临床试验miRNA研究领域特点940个miRNA细胞组织器官干细胞生殖疾病：肿瘤心脑血管疾病神经疾病整体miRNA研究领域分布锐博生物miRNA研究策略miRNA研究解决方案miRNA表达检测miRNA筛选分析miRNA靶点分析miRNA细胞功能miRNA动物验证细胞或组织通过qRT-PCR、miRNA芯片、深度测序等进行miRNA表达谱分析3’UTR报告基因筛选高内涵细胞功能筛选报告基因的筛选信号通路筛选3’UTR报告基因验证靶基因siRNA验证qPCRmRNA验证WB蛋白验证过表达或者抑制miRNA的表达验证其对细胞表型的影响体内过表达或者抑制miRNA表达验证其对模型动物的影响Bulge-LoopTMmiRNAqRT-PCR引物Bulge-LoopTMmiRNAqRT-PCR标准品Bulge-LoopTMmiRNAqRT-PCR检测服务Bulge-LoopTMmiRNA表达谱检测服务miR-Ribo™mimics文库miR-Ribo™inhibitor文库3’UTR报告基因反向miRNA筛选服务细胞增殖、凋亡、周期等表型筛选服务信号通路筛选服务pmiR-RB-ReportTM3’UTR报告基因载体3’UTR报告基因验证服务siR-RiboTMsiRNAmiR-Ribo™mimicsmiR-Ribo™inhibitormiR-Ribo™表达载体miR-Ribo™spongeCell-LightTMEdU细胞增殖等检测试剂盒miR-Ribo™agomirmiR-Ribo™antagomrmiR-Ribo™表达载体miR-Ribo™sponge研究方案产品与服务锐博生物miRNA相关产品与服务‘miRNA的检测三种检测方法的比较能不能不能能否区分序列差别少的miRNA是否（需要额外的区分大小的步骤）是（miRNA数目少时无法区分）区分前体与成熟miRNA的可靠性几小时几天几天实验时间中等、高高低通量7logs4logs2logs动态范围高中等低特异性高中等低敏感度1～10纳克大约5微克5～10微克初始样本量定量实时PCR微点阵Northern印迹Bulge-loopRT-PCRLoopBulgemiRNAStep1:miRNARTForwardPrimerReversePrimerStep2:Real-timePCRSybrGreenBulge-LoopRTPrimer一套引物：RT-primerForwardprimerUniversalreverseprimer阳性对照：miRNAstanded服务：miRNA定量检测miRNA表达谱分析总RNA或miRNA抽提Bulge-LoopqRT-PCR特异性UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUUhsa-let-7gUGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUUhsa-let-7iUGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUUhsa-let-7fUGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUUhsa-let-7eAGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUUhsa-let-7dUGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUUhsa-let-7cUGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUhsa-let-7bUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUhsa-let-7aMaturemiRNAsequencemiRNA1.000.000.000.000.000.010.000.00hsa-let-7i0.151.000.000.000.000.000.000.00hsa-let-7g0.020.001.000.000.010.010.000.01hsa-let-7f0.290.000.001.000.000.010.000.01hsa-l