蛋白质的分离纯化方法一

第七章蛋白质的分离、纯化与表征一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子的大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定四、蛋白质分离纯化的一般原则五、蛋白质的分离纯化方法一、蛋白质的酸碱性质蛋白质是一类两性电解质，能与酸或碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基团由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。等电点：在某一pH，它所带的正电荷与负电荷相等。蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。二、蛋白质分子的大小与形状（一）根据化学组成测定最低相对分子量如Mb含铁量为0.335%，其最低相对分子质量为：Mb最低相对分子质量＝铁的原子量铁的百分含量×100＝55.8/0.335×100＝16700Hb最低相对分子质量＝16700×4牛血清白蛋白含Trp0.58%最低Mr=35200，实际为69000，含2个Trp楚雄师范学院化学与生命科学系范树国（二）渗透压法测定相对分子量用半透膜将蛋白质溶液与纯水隔开，当渗透达平衡时，测定其渗透压，计算分子量：Mr＝RTlimπcc→0C：浓度（g/m3）R：气体常数（8.314J/(K·mol))T：绝对温度（K）：以大气压表示的渗透压(N/m2)（三）蛋白质的扩散和扩散系数扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散的热力学驱动力是熵的增加。扩散系数D：等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。扩散系数随Mr的增加而降低，但对Mr的变化不敏感。对球形的大分子来说，扩散系数与Mr的立方根成反比。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国（四）沉降分析法测定相对分子量楚雄师范学院化学与生命科学系范树国1.沉降速率法楚雄师范学院化学与生命科学系范树国2.沉降平衡法楚雄师范学院化学与生命科学系范树国（五）凝胶过滤法测定蛋白质相对分子量（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）蛋白质的胶体性质蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达尔现象，不能通过半透膜）。透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基团数量越多，溶解度越大。稳定蛋白质胶体溶液的主要因素①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集而沉淀。一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国（二）蛋白质的沉淀①盐析法向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。②有机溶剂沉淀法破坏水化膜，降低介电常数。③重金属盐沉淀pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+.Pb2+.Cu2+等）结成不溶性沉淀④生物碱试剂和某些酸类沉淀法pH小于等电点时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。⑤加热变性沉淀往往是不可逆的。四、蛋白质分离纯化的一般原则纯化的实质：增加制品(preparation)的纯度或比活性。①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存楚雄师范学院化学与生命科学系范树国电泳前处理粗分离细分离生物组织无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析1、前处理：①将组织和细胞破碎动物组织和细胞：电动捣碎机（waringblender)匀浆器（homogenizer)超声波处理（ultrasonication)植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨纤维素酶处理细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）②差速离心法收集细胞的某一组分（differentialcentrifugation)：在不同离心力下沉降的细胞组分③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国2、粗分级（roughfractionation)一般用选择性沉淀法。①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）②等电点选择性沉淀法③有机溶剂分级沉淀法④热处理选择性沉淀法⑤生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法3、细分级（finefractionation)①透析除盐②sephdexG-25凝胶过滤除盐★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳★密度梯度离心4、浓缩与保存浓缩方法：保存方法：①晶体保存：结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。②冻干粉保存：③溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后-20～-70℃保存。五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法1.透析和超滤透析：半透膜阻留蛋白质分子，而让小的溶质分子和水通过，以除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。超滤：施以一定的压力使小分子溶质通过半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子楚雄师范学院化学与生命科学系范树国沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析。2.密度梯度（区带）离心蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度楚雄师范学院化学与生命科学系范树国3.凝胶过滤交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）；琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-GelA）楚雄师范学院化学与生命科学系范树国交联葡聚糖（Sephadex）楚雄师范学院化学与生命科学系范树国（二）利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀和pH控制在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。在pI时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国2.蛋白质的盐溶和盐析盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度增加。盐析：高盐浓度时，使蛋白质溶解度降低析出。盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的饱和溶液。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国3.有机溶剂分级分离法与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随者变性。在一定温度、pH和离子强度条件下，引进蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分离蛋白质。有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介电常数；另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。水溶性非离子聚合物如聚乙二醇（PEG）也能引起蛋白质沉淀。聚乙二醇的主要作用可能是脱去蛋白质的水化层。聚乙二醇与蛋白质亲水基团发生相互作用并在空间上阻碍蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二酵中的溶解度明显地依赖于聚乙二醇的分子量。4.温度对蛋白质溶解度的影响在一定的温度范围内，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国（三）根据电荷不同的纯化方法1.电泳在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳(electrophoresis)或离子泳(ionphoresis)。电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要于段，而且也是研究蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（PAGE，琼脂糖胶，淀粉胶等）楚雄师范学院化学与生命科学系范树国2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）3.毛细管电泳楚雄师范学院化学与生命科学系范树国4.等电聚焦电泳等电聚焦电泳法测定蛋白质pI5.SDS-PAGE6.离子交换层析离子交换纤维素：离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应离子交换交联琼脂糖：楚雄师范学院化学与生命科学系范树国（四）利用选择性吸附的纯化方法极性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键）非极性：活性炭（范德华力、疏水作用）最广泛最有效：羟基磷灰石（hydroxyapatite)，即结晶磷酸钙[Ca10（PO4）6（OH）2]，可分离蛋白质、核酸，与DNA的亲和力最高层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex)辛基琼脂糖(octa-sephadex)洗脱：低盐高pH非离子型去污剂（tritonx-100)脂肪醇（丁醇、乙二醇）（五）利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。免疫亲和层析凝集素亲和层析金属螯和层析染料配体层析楚雄师范学院化学与生命科学系范树国六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定（一）蛋白质含量测定总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法。特定蛋白组分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）其它蛋白：抗原抗体反应(westernblot)楚雄师范学院化学与生命科学系范树国楚雄师范学院化学与生命科学系范树国楚雄师范学院化学与生命科学系范树国（二）纯度鉴定（均一性）基本手段：电泳分析：单条带。N端测定：1种N端氨基酸。选用手段：沉降分析、溶解度分析、结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性）其它鉴定工作：1.分子量的测定；2.等电点测定；3.N-末端AA测定；4.C-末端AA的测定（肼解法）；5.分子中糖链：①血球凝集反应；②糖蛋白电泳（甲苯胺兰、R山兰、schiff试剂）；③糖组分分析（层析、液相色谱）6.含脂成分：苏丹黑预染、电泳。7.光吸收：全波长扫描。找出它的吸收峰位置和最大吸收值。8.AA组分分析。