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CytomicsTMFC500型流式细胞仪培训教程美国贝克曼库尔特公司（BeckmanCoulterLtd.）流式产品部CytomicsTMFC500系列流式细胞术系统CytomicsTMFC500系列是一个装备了目前能获得的最先进技术的尖端产品家族。FC500系列具有灵活的检测功能，强大的软件和用户友好的操作界面，总之，能帮助研究人员获得最佳化的工作流程和最高的工作效率。同时，每一台FC500系统都能享受BeckmanCoulter公司的仪器质量和售后服务的卓越信誉。为研究性实验室设计了精密的、高效的操作程序采用单激光或双激光激发方式，可进行5色分析配备共线性（collinear）的第二根激光，对抗体和荧光色素的选择具有更大的灵活性排除延时计算的需要和伴随的空间-分离光束的干扰应用先进的数字补偿（AdvancedDigitalCompensation,ADC）可简化多色分析BeckmanCoulterADC技术是目前所能达到的最先进和最准确的颜色补偿技术。该技术能高效校正光谱重叠，从而获得更准确的结果。应用ADC技术，生物样品的测定可获得自动的颜色补偿，并不受乳胶微珠的限制。只有BeckmanCoulter流式细胞仪提供了享有专利权的数字信号处理系统（DSP），故能达到最佳的线性效应、无漂移的放大作用和颜色补偿。在单激光下进行5-色分析变得无比容易只有FC500系列的流式细胞仪能在单激光或双激光条件下对多种不同的荧光色素进行荧光参数分析。应用独特的数据简化显示的柱形图,进行五维自动化表型分析，可以在单一位点上分析出多达32种不同的表型应用充分可见的发射光谱能拓展多色分析的范围，从而更提高仪器的灵活性水平CXP软件可进行自动的数据获取和应用设置BeckmanCoulter高效CXP软件是FC500系列的宝贵组件。它的Windows环境的平台使操作人员能自动化操作仪器装置和获取数据，因而既使用方便又节省时间。自动化调控装置使日常操作程序标准化的装置以及PMT电压和补偿值的质量控制装置，为用户提供多方便利自动化地报告质量控制结果简明的补偿设置及其调节对执行多种应用的研究者来说是理想的选择应用FCS3.0,20-位数据可进行在线和脱机两种列表方式的补偿当样品正在采集中或已经采集结束后都可进行数据的处理W XYYWúR !#$%®ZY [®\#™l]]¨^»¹»_``a°b(ìcdefghfi( !#$%ZY [\# #™j kÈOl+èçµ&?@AiÕB Ó&-CDߣäy°EmCD'(£ÑÒÞr) CDr*+,-D rÌ CDrC.89(=?@?@$%ABCDEF#GHIJKLMNO)PQHR kN¶mino kpqr ksët(uvnѵwxYððôòóZ÷íy™ARz-Z%ZÜ{ ôõö|-z-Z÷íy™Ü{{$z-Z÷íy™Ü{in}nAÍ k~ëf:(mQ$÷óðóW|™nѵ A kÑWY$ %` Z XZ Z Z Z ìcdefìcdeftH=Øyf`XtH=Øy \ØZíñïrinsët(uv§Q LMrsz¡¢£¤¥¢¦§ jA#íôïñ[ô÷í™ kѨ © ª fìcìcdeff`XtH=Øy \Zíñ﫬ino kpqr kuv& kLMrszff kѨ fìcìcdeff`4567 !#$%&'()*( ! kçèino kpqRr kuv& kLMrsz W® |! _bW kѨ fìcìcdeff`¯C© kin°±ª_$!bîó÷|yó²y|òí!_ Z!b³§ª_ !b kѨ f© fH=ØìcìcdefH=f`H=f89(=?@bcdefghij #$%&' #()$%*+,-.$%bfggcCDE?hÕ}3dUV@-Àixe+,juvfJJ@b/ èJvWX¥;¦UV@ c èJvWX UV@¶È d0 èJvWXCDE?#STgh dcb /0 1$%2345$%^deñéÛc@ñ-.1ãHÆÇâã£12JJ341ã\] bt[YZLc±[YZLd5[YZLbcdb ge gRh èJ6µ78c gf g æÉ$i}}d gKg }j9 èJÉ$vHÉ$·: g Ãbcdefghij 6&789$%* :$%;=?@ABCD/Ebu`Lcý`vwdtu`dbcd FGHIJµA?@½±ç¡®øé ¼289!±;µAuv¡®A|}¦r -KL=ME&!²³y-WwxA89 WwxG=²³A¦r89ðWwxáÜ NECMultiSyncLCD1700M+fXghijgklghSYSTEMPOPWERMCLPOPWERSYSTEMPOPWERMCLPOPWERWATERTRAPVACTRAPAIRFILTERVACFILTERSYSVACSYSPRESS30PSIPRESSADJFC500用户培训大纲预期目的：通过第一次培训后能够达到以下要求：1，了解流式细胞仪的基本原理2，了解FC500的基本结构、开机程序及常规保养3，了解XP的软件结构并能运用其进行数据采集和结果分析等基本功能4，掌握单标记及多标记免疫荧光标记的原理及基本要点，熟悉基本的标本制备过程，能够进行方案设计，能够运用QPREP。5，了解DNA检测的原理及基本要点熟悉基本的标本制备过程，能够进行方案设计，能够运用DNAPREP，并能运用MultiCycle进行细胞周期分析6，了解并掌握流式质控的几个步骤以及相关质控品，初步了解QC数据库的使用。培训内容及课时安排(每半天为一个教学课时)第一课时：1，流式细胞仪基本原理概述2hr流式的结构及各部件功能：激光，流动室，鞘液，样本要求，光电倍增管，电压及增益，放大方式，阈值，检测信号种类，荧光染料种类，分色方式，道数，直方图以及分析工具2，硬件及软件介绍，第二课时3，练习建立方案2hr4，开机步骤，FLOWCHECK原理及光路与流路校准操作，练习电压变化引起的信号强度变化(1hr)第三课时5，免疫荧光(单标记)：原理，方案，同型对照设定，QPREP或OptiLyseC使用，CytoTrol及全血标本制备(23hr)第四课时6，免疫荧光(双标记)：方案，同型对照设定，颜色补偿原理及补偿设定，全血标本练习(23hr)第五课时7，免疫荧光(三标记)，示范及练习(12hr)第六课时9，质控品、自动质控程序及质控数据库介绍：FlowCheck，FlowSet，CytoTrol，ImmunoTrol，FlowCount，StemTrol利用FlowCheck演示QC数据库10，总结及试剂介绍第七八课时11，DNA检测及分析：检测原理方案设计：阈值，PEAK峰的概念，RATIO，设计一个DNA数据采集方案，并解释仪器自带的DNA方案标本制备(利用DNAPREP试剂)细胞周期分析原理以及MultiCycle应用第九课时12，应用介绍流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法。它结合了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。利用流式细胞仪可以对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观、多参数相关的检测。流式细胞仪组成Cytometer流式细胞仪主机Workstation流式细胞仪工作站PowerSupply电源箱MCL自动进样器流式细胞仪工作原理光源：激光(488nm氩离子空冷激光/633nm氦氖空冷激光)液流：鞘液(SheathFluid)细胞：单细胞悬液流动室：FlowCell检测器：光电倍增管(PMT)光电二极管检测信号：散射光(FS，SS)，荧光信号(FL1~FL5)统计分析：计算机激光：488nm氩离子空冷激光/633nm氦氖空冷激光注意环境温度及距离鞘液及流动室：前前向向散散射射光光Injector鞘液侧侧向向及及荧荧光光信信号号光电倍增管：检测信号：散射光信号：FS：细胞大小SS：细胞颗粒性荧光信号：FL1~FL5下图示：仪器如何通过FS检测细胞大小及通过SS检测颗粒特性分光原理：利用二向色性长通滤片(DL)及带通滤片(BP)可将不同荧光染料发出的相应波长光谱区别开。二向色性长通滤片(DICHROICFILTER)一定波长以上的光通过，该波长以下的光被折射。45度角放置550nmDL光源通过光折射光550nm的光通过550nm的光被折射带通滤片(BANDPASS)允许一定波长的光通过。620nmBP可以允许610~630nm的光通过信号放大方式：经过PMT将光学信号转变为电脉冲信号，并增加PMT的电压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种：线性放大(Lin):AMP对数放大(Log)AMP通常散射光信号用线性放大，荧光信号用对数放大。但是注意血小板的散射光用对数，而DNA的荧光信号用线性。A/D转换：不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程直方图阈值(Discriminatior):RequiredSignal通常在进行免疫标记分析时，阈值设在FS=100~150DNA分析时设在FL3PEAK=30~50峰值信号(PEAK)与积分信号(INTEGRAL)免疫荧光分析原理：细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。意义：流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都起了重要作用。单标记免疫荧光分析对数坐标阴性对照----IsotypeControl(去除非特异性结合)CD4--FITC—IgG1双标记免疫荧光分析特异性结合非特异性结合同单标记颜色补偿颜色补偿(ColorCompensation)颜色补偿是用电子的方法校正荧光染料光谱之间叠加所造成的误差，在完成双色以上的免疫荧光分析时都需要作颜色补偿。一种荧光染料不只发出一个波长，而是一定范围的波长。只是其中一部分较其他染料“亮”。带通滤片接收的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%如上图所示：FL2(575BP)在接收RD1的同时，亦接收了一部分FITC(干扰)。这部分干扰占FITC总量的X%。故真正的FL2=实测RD1(FL2)-干扰的FITC(FL1)。即通常所说的：FL2-X%FL1放大颜色补偿判断标准：放大分析未作颜色补偿补偿后颜色补偿总结标本制备单细胞悬液外周血骨髓培养细胞组织：机械法、酶法单细胞悬液标本浓度106/ml取100ul正常全血100ul抗凝剂EDTA3K（15%）约10微升抗凝1毫升全血肝素若抗凝不佳，有凝块，则不可检测红细胞裂解裂解液的选择：保持细胞形态红细胞裂解完全反应温度抗原抗体结合的最佳温度为26~27ºC。避光。全血标本制备(免疫标记—直标法)•取100ul全血加入12X75mm试管中•加