蚊虫的抗药性监测方法-孟凤霞

蚊虫的抗药性监测方法孟凤霞博士硕士生导师中国疾控中心传染病所媒介生物控制室研究员Tel：[e-mail]我们的卫生用杀虫剂的市场„杀虫剂农业用杀虫剂90%公共卫生用杀虫剂10%很多蚊、蝇等重要病媒生物的抗药性产生受到农业、林业等活动的影响，其影响程度与蚊虫的孳生地有极其密切的关系.Registedinsecticideforvectorcontrolin2004,intheworld010203040506070cockroachmosquitoflytermiteantfleaacridtargetinsectTotalNo.ofinsecticideformulationothers,15%mosquito-repellentmat,20%electricmosquito-repellentmat,12%mosquito-repellentliquid,5%handheldaerosols,48%Theformulationsofregisteredhygieneproductsin1998第一部分常用的抗药性监测方法„生物学测定方法——生测法„生理生化测定方法„分子生物学测定方法第二部分抗药性研究方法几个容易混淆的概念„监测与检测„监测与调查„毒力与药效„毒力与毒性„抗药性与耐药性„“杀虫剂或制剂对淡色库蚊的毒力或药效”与“淡色库蚊对杀虫剂的敏感性”„毒力：指药剂本身对不同生物发生直接作用的性质和程度，一般是在相对严格控制条件下，用精密的测试方法，及用标准试虫而对杀虫剂的一个度量，这是一个评价或比较的标准。毒力测定一般多在室内进行，测定的结果不能直接应用现场工作中，只能作为一个防治上的参考。„药效：是药剂本身和各种因素综合的结果。不同的剂型、不同的病媒生物、不同的使用方法、不同的环境对药剂的作用效果都非常有关，这是非常接近实际的一种测定，在应用中具有非常重要的价值。二、试验方法幼虫毒力回归线法——浸渍法幼虫毒力回归线法——浸渍法幼虫诊断剂量法——浸渍法幼虫诊断剂量法——浸渍法成蚊诊断剂量法——药纸筒接触法成蚊诊断剂量法——药纸筒接触法分子监测方法——PCR分子监测方法——PCR试验设计试虫的准备药剂的准备药剂的配制药纸的制备野外试虫室内试虫试虫的采集方法试虫的储运方法试虫的饲养方法试验结果统计和分析试虫的采集„了解蚊虫的发生规律、在其发生高峰期的活动采集。„采集的方法：诱蚊灯、灭蚊磁、吸管、电动吸蚊器、捞勺、漏勺。„保证其不受机械损伤，生命力强。试虫的储运方法„幼虫——水桶、50毫升离心管„成蚊——养蚊笼、纱网„注意事项：不能有高温（放置在车的后背箱非常危险）、成蚊不能干燥且要有糖水提供能量。试验的使用方法„不同的蚊子要求不同，食料也不同，同时不同生理状态下的蚊虫的饲养条件不同如三带喙库蚊做吸血与非吸血时的吸血性不同。药剂的准备„原药而不能使用制剂，原药含量越高越好„杀虫剂的保存：原药与母液-20度低温冰箱，母液可以放1-2个月，及配制好的药液4度放置1周。„药剂的配制过程：取出分装后的原药，30分钟后打开盖子，使其与室温一致。用硫酸纸称取非液体原药，用容量瓶称取液体原药，拟除虫菊酯类杀虫剂配制5mg/ml母液，有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂配制成10mg/ml母液，用丙酮做溶剂。„要求母液的配制要2人同时进行。药剂的准备„系列浓度的设计„依据：既往资料，文献。根据其LC50或LD50、家蝇还有注意使用的点滴器大小，推算测定所需要的浓度。„配制的母液可分装至小瓶中，用封口膜密封-20度保存，待用。需注明药剂名称、浓度、配制人、时间。„预实验：找出死亡率在10~90%的测定浓度或剂量。正式试验:5~7个系列浓度，同时设立对照。有3次重复，对照的死亡率大于20%，化蛹率高于10%，试验作废。每个处理试虫数要60~100较好，至少要30个以上。区分剂量法一般用敏感基线的LD99(或LC99)或2倍LD99(或LC99)为区分剂量，在此剂量下能够存活的个体为抗性个体，此方法可以作为早期抗性的指标。区分剂量的确定与抗性遗传方式有关，不完全显性抗性遗传的区分剂量由于杂合子和抗性纯合子难以区分，较难确定，其他遗传方式较易确定。区分剂量的抗药性一般使用抗性个体百分率表示。然而，在具有较高抗性水平时本方法不易使用。1.2毒力回归线测定方法在药剂对害虫的10％－90％死亡率的范围内，等比设计药剂的系列浓度，在特定的环境条件下测定一定虫态试虫的死亡率，求出致死中量或致死中浓度，与敏感品系比较计算抗性倍数。小结试验设计和测定步骤在试验以前首先进行试验设计，每一步都明确后在进行试验。1配药配药前设计好，配药中应该有详细记录，便于查找，以免发生错误；2试验条件一致，标准试虫和试虫数量、性别、虫龄3点滴、药膜处理或喷雾4结果检查5数据统计1.3生物测定注意事项1)试验过程有详细记录；2)所有用具都清洗干净，以免影响试验结果；3)在通风橱内操作，戴手套、口罩或眼罩等，注意自我保护；4)数据出现倒置时，认真查明原因，抗性水平高时其数据分布有时更不均匀、取样时也可能有误差，不要轻易舍弃。敏感基线在药剂使用以前，害虫对药剂的敏感性基线称为该药剂对这种害虫的敏感基线。敏感基线的高低直接影响所测定的抗性倍数，是昆虫重要的特性之一。2.生理生化测定方法不同药剂的生理生化抗性杀虫剂抗药性有关的作用靶标或代谢酶DTTNa+通道，多功能氧化酶，DTT-脱氢酶六六六氯离子通道，多功能氧化酶有机磷乙酰胆碱酯酶、多功能氧化酶、酯酶、谷胱甘肽-s-转移酶系氨基甲酸酯多功能氧化酶、酯酶拟除虫菊酯神经不敏感、多功能氧化酶、酯酶、表皮穿透性烟碱、吡虫啉乙酰胆碱酯酶受体环戊二烯类、锐劲特γ-氨基丁酸(GABA)受体苏云金杆菌中肠受体2.2常用的抗药性生化测定方法生化监测方法可以使用分光光度计、酶标仪监测到每个个体靶标酶或代谢酶的变化，一般用I50(药剂对酶的抑制中浓度)表示药剂对离体酶的抑制能力；Ki表示酶与底物的结合能力的大小。见附表2（200页）、附表3（200—201页）应该注意：1试虫标准化，低温制备酶液。2生物化学测定的缺陷只能测定一种酶的变化，抗药性的产生常常是多种酶共同参与的结果。化学农药和植物次生物质对棉铃虫酪氨酸酶的抑制动力学研究摘要用双光束扫描分光光度计的时间驱动程序测定酶促反应速度，研究了几种化学农药、植物次生物质和特异性抑制剂对棉铃虫酪氨酸酶的酶促抑制动力学。结果表明：某些有机磷化合物和植物次生物质对棉铃虫酪氨酸酶有抑制作用。辛硫磷、对硫磷、芸香苷、单宁和苯基硫脲的抑制中浓度I50分别是0.0386、0.0599、0.4511、1.5018、0.5288mM和4.2609nM。辛硫磷、对硫磷和芸香苷对棉铃虫酪氨酸酶的抑制作用，随着抑制时间的延长而增加，而苯基硫脲和单宁的抑制作用则无明显变化。辛硫磷、对硫磷、芸香苷和苯基硫脲对棉铃虫幼虫酪氨酸酶抑制为混合型抑制，双分子速率Ki分别为1634.39、40.81、53.61和2.03×1010M-1·min-1，而单宁为反竞争性抑制，其Ki为32.24M-1·min-1，表明，苯基硫脲和辛硫磷对酪氨酸酶的亲和抑制能力与其它相比较强。可见，棉铃虫的酪氨酸酶可以作为农药对害虫作用的新靶标进行开发研究。3抗药性的分子生物学监测方法只有在明确了害虫对药剂的抗药性机理以后，才能准确进行。常用杀虫剂的主要抗药性机制见前表。3.1乙酰胆碱酯酶基因果蝇的乙酰胆碱酯酶基因研究较多，其次是家蝇。乙酰胆碱酯酶由两个亚基组成，其酯动部位和阴离子部位分布在不同的亚基上，这两个亚基的多肽由同一个基因编码。抗性水平常和突变点的多少有关，一般突变点越多其抗性水平越高。3.2钠离子通道基因由2000多个氨基酸组成，6个结构域，家蝇的与抗性有关的点突变常为1个氨基酸的变化，在蜚蠊中也已经拿到与其同源的与抗性有关的基因。3.3γ-氨基丁酸受体突变与抗性的关系英国在对环戊二烯有2万倍以上抗性的果蝇研究表明，其抗药性为单基因控制，造成抗药性是由于多肽中302位丙氨酸突变为丝氨酸，并以此为探针用于抗性监测上。3.4酯酶扩增与抗药性的关系英国洛桑试验站对抗性桃蚜的研究表明，酯酶活性的变化与基因扩增有关。3.5多功能氧化酶-P450与抗药性的关系3抗药性的分子生物学监测方法4抗药性研究方法„野外试虫采集„试虫的室内饲养„试虫标准化„抗药性监测方法的选择：（1）生物测定方法：敏感品系和敏感基线，毒力回归线，区分剂量；（2）生化监测方法；（3）分子生物学监测方法：kdr抗性基因的检测、代谢酶系的检测、。„交互抗性研究方法„抗药性遗传规律研究方法„抗性风险评估„抗药性治理策略研究抗药性监测中存在的误区——方法错误刘鉴等，1999用幼虫浸渍法监测杀成虫剂的抗药性药剂、作用机制、试虫与测定方法是应该是对应的。抗药性监测中存在的误区——取样没有代表性成蚊接触桶法„以溴氰菊酯为例说明„实验原理„采用诊断剂量，通过药膜接触法测定蚊虫的抗药性现状，验证说明幼蚊实验的结果。并直观说明杀虫剂对蚊虫击倒抗性及其致死率的表现。„实验药剂„母液：溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氯菊酯、DDT、马拉硫磷、残杀威均为10mg/mL。„乙醚、丙酮„实验用具„药膜制作所需：新华1号滤纸或质量相近的其他滤纸，玻璃板（20cm×20cm），夹子，注射器，试剂瓶，乳胶手套，化学防护口罩，记号笔，标签纸，自封袋，黑塑料袋„接触桶，恢复桶，棉花，光照培养箱致倦库蚊埃及伊蚊按蚊杀虫剂类型杀虫剂区分剂量(接触时间h)区分剂量(接触时间h)区分剂量(接触时间h)有机氯DDT4%(4)4%(0.5)4%(1)狄氏剂4%(1)0.4%(1)0.4%(1)有机磷杀螟硫磷1%(2)-1%(2)马拉硫磷5%(1)0.8%(1)5%(1)氨基甲酸酯残杀威0.1%(2)0.1%(1)0.1%(1)拟除虫菊酯高效氯氟氰菊酯0.025%(1)0.03%(1)-氯菊酯0.25%(3)0.25%(1)0.25%(1)溴氰菊酯0.025%(1)-0.025%(1)WHO推荐的几种杀虫剂对蚊虫成蚊的区分剂量药纸的制作„制作30张0.025%溴氰菊酯药纸：„材料的准备„准备16厘米×12.5厘米（200cm2=1/50m2）的新华1号滤纸或质量相近的其他滤纸30张。„拟除虫菊酯为5mg/mL母液；有机磷为100mg/mL母液，或其他浓度的母液，所有母液的配制用丙酮为溶剂。„用2块清洁的玻璃板（20cmX20cm）。平板夹8个。10、30或50毫升的一次性注射器各2-4只，一种药剂1个，根据制作药纸的数量来确定使用的注射器型号。100mL、试剂瓶若干（一张药剂要用2个，2种药3个，3种药4个，依次类推）。„乳胶手套、化学防护口罩如干，记号笔、标签纸、自封袋、黑色纸袋若干。„配制白油、乙醚和药剂的混合液：按白油、乙醚(AR)=1∶2（即23毫升白油加44.85mL乙醚，加1.15mL5mg/mL丙酮溶解的母液）比例混合，得到白油、乙醚和药剂的混合液69毫升，备用。注：69毫升混合液可以制作32.24张药纸，药液比需要使用的量稍多，补充操作过程中的损失。„用注射器向家在玻璃板中间的滤纸慢慢注射药剂，为了药液均匀，可以在不同方向注入。„将药液分布均匀后，撤掉玻璃板，在通风橱中晾干，标记日期、浓度、制作人后用密封保存。„蚊虫的选择及接触桶使用„选择羽化后2-5天未吸血的雌蚊，每个对照桶中20只，直立，确定无死亡或受伤的蚊虫后，将蚊虫吹入接触桶中关闭两桶之间的隔板，水平放置，接触所需时间。（接触桶表面标有红点，恢复桶表面标有绿点）„击倒及死亡率的记录„击倒的判别标准为：身体不动或反转，足朝上能运动但不能自主翻转。„死亡的判别标准为：身体不动。„实验数据的处理„死亡率以雌蚊的死亡率为最终数据。对照组死亡率超过20%，则数据无效。关于抗药性监测与治理讨论„在注意监测击倒抗性的同时，注意监测代谢抗药性；„针对不同的靶标蚊虫对相应杀虫剂的抗药性机制，通过多种检测技术，综合分析一定区域的靶标蚊虫的抗药性，即了解一个