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第一章：基因工程概述1．重组DNA技术、分子克隆技术与基因工程在概念上的主要区别是重组DNA技术：即分子克隆技术，指将某一生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入到另一生物体（受体）细胞中，使之按照人们的意愿稳定遗传和表达相应新产物或新性状的体外操作程序。基因工程：重组DNA技术的产业化设计和利用，这里既包括上游技术（重组DNA技术），也包括下游技术（发酵和基因产物的分离和纯化）。2．基因工程的三大要素是什么供体载体受体3．重组DNA技术的五大单元操作过程分别是什么切：从供体细胞中分离基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体切开接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到载体分子上，构成重组DNA分子转：借助于细胞转化手段将重组DNA分子导入受体细胞中增：短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到染色体DNA上检：筛选和鉴定经过转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的工程菌。4．简述外源基因稳定高效表达的主要战略思想1．提高拷贝数2．提高转录量。3．提高翻译量4．提高工程菌的生产6．试比较四代基因工程的基本定义第一代蛋白质多肽基因的高效表达经典基因工程第二代蛋白质编码基因定向突变蛋白质工程第三代代谢信息途径的修饰重构代谢途径工程第四代全基因组或染色体转移基因组工程7．如何理解重组DNA的安全性载体：不使用结合型质粒，而用安全的非结合型质粒。受体：受体采用具有湖泊型突变体校正功能的大肠杆菌8．简述基因工程（包括重组DNA技术）的三大用途。1分离、扩增、鉴定、研究、整理基因信息资源2规模化生产活性物质3设计构建生物新性状甚至新物种第二章：DNA重组克隆的单元操作1．用于DNA重组克隆的载体的功能是什么1．运送外源基因进入受体细胞2．为外源基因提供复制或整合能力3．外源基因提供扩增和表达的必要条件必须具备四个条件：1．丰富的酶切位点2．对受体细胞有可转移性3．在受体细胞中稳定遗传4．具有合适的标记，便于检测。2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么自主复制性：不依赖于染色体DNA，自主复制可扩增性：G-菌种松弛型复制和严谨型复制可转移性：结合性，能转移到另一菌体中，基因工程用非结合型不相容性：对已经侵染的质粒或类似质粒免疫3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义具有相同或类似复制子结构或调控模式的两种不同质粒不能稳定存在于同一个受体细胞中4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途高拷贝突变拷贝基因，拷贝数1000-3000，用于扩增基因低拷贝来自pSC101，拷贝数低于10，表达毒性基因温敏在不同温度下表现出不同的拷贝数测序含有测序通用引物互补序列与多酶接头整合装有整合促进基因和位点，便于外源基因整合到染色体DNA上穿梭装有针对两证不同受体的复制子，便于基因克隆表达装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化原件探针装有报告基因便于启动子等原件克隆筛选COS质粒由λ-DNA的cos区域质粒DNA重组组成。5．II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别和切割位点具有严格特异性6．在DNA重组克隆实验中为什么通常使用T4-DNA连接酶而不用其他连接酶1．有更广泛的底物适应性2．修复DNA-DNA链上的单链缺口（大肠杆菌也有）、DNA-RNA杂交链上的缺口3．连接平头双链DNA分子7．KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别大肠杆菌DNA聚合酶I在枯草杆菌蛋白酶处理下获得的C端2/3的肽段。Klenow酶：具有5’→3’DNA聚合酶活性，3’→5’核酸外切酶活性，缺失5’→3’核酸外切酶活性8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？1.温度、盐度等物理因素2.DNA样品纯度3.DNA甲基化程度4.限制性核酸内切酶的缓冲液性质.Star活性：极端条件下限制性核酸内切酶的专一性变低，会识别和切类似切口。9．如何理解粘性末端比平头末端更容易连接粘性末端在退火条件下为分子内反应平头末端是分子间反应，反应更加复杂，速度也慢10．在重组DNA技术中常使用的微生物转化方法有哪些？G-菌：Ca2+诱导转化（形成液晶，便于DNA分子进出）有细胞壁：PEG介导（先溶酶体去壁，加入DNA转化，再生细胞壁）电穿孔：电场脉冲下直接处理。11．为什么外源DNA难以转化野生型的微生物受体细胞1.外源DNA会被识别，从而被降解2.即使被转化进去，重组质粒的逃逸3.转座元件促使重组DNA的缺失和重拍4.影响细胞代谢，使得工程菌生长慢于普通菌。12．简述转化率和重组率的基本概念以及在DNA重组克隆实验中的指导意义。转化率：每微克载体DNA转入受体细胞的分子数重组率：含有外源DNA的重组分子数/载体分子数(一般25%-70%)指导意义:某DNA重组实验的重组率为20%转化率为107每微克,经过处理后的载体转化率吧要比天然的降低100倍.要获得104个重组克隆,需要多少载体DNA进行重组实验:解:处理后的重组DNA转化率=105每微克重组率100%条件下需要：104/105=0.1微克0.1/20%=0.5微克载体DNA13．简述转化子筛选与重组子鉴定的三大基本战略载体遗传标记检测抗药性检测营养缺陷型检测显色筛选克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法菌落原位杂交法PCR扩增法DNA序列分析法外源基因产物检测蛋白质生物功能检测法DNA结合蛋白检测法southernwestern检测抗菌素抗性鉴定放射免疫原位杂交鉴定免疫沉淀聚丙烯酰胺凝胶法，找粗条带14．探针、引物、接头的物质基础和用途分别是探针小段单链DNA或RNA用于检测与其互补的核酸序列引物小段单链DNA或RNA作为DNA复制的起点接头平头双链DNA更换粘性末端15．简述分离克隆目的基因四大战略及其适用范围鸟枪法原核细菌目的基因的克隆cDNA法获得mRNA，除去内含子PCR法知道基因的两侧序列或中间序列化学合成法知道全基因序列16．简述基因文库的基本概念以及构建技术要点。基因文库含有全部基因鸟枪法获得cDNA文库含有全部蛋白质编码基因cDNA法获得基因文库的完备性：f增大N增大用装载量大的装载体N克隆数=ln（1-P出现在基因文库中的概率）/ln（1-f克隆片段平均大小/生物基因组大小）第三章：大肠杆菌的基因工程1．简述外源基因在大肠杆菌中高效表达的基本原理包括：强化蛋白质生物的合成（拷贝数、转录水平、mRNA的翻译控制）、抑制蛋白质产物的降解、维持和恢复蛋白质特向异性空间构象三方面。生物合成:启动子：（DNA→RNA）启动子的筛选、启动子最佳距离（Bal31）、操纵基因终止子：（DNA→RNA）强启动子结合强终止子SD序列：（RNA→蛋白质）mRNA起始翻译区域密码子：（RNA→蛋白质）偏爱性，tRNA含量拷贝数：高拷贝提供多基因2．决定密码子偏好的主要因素是什么？1.碱基数量（有些偏好GC有些偏好AT）2.20种tRNA的丰度在不同细胞内是不一致的。解决密码子偏好性有两种方案：1改变外源基因中的部分碱基，使其符合宿主细胞的偏好性2将编码缺失tRNA的基因装在其他载体中先行转录表达3．包含体的基本特征和形成机制是什么包涵体基本特征：在某些生长条件下，特殊的生物大分子致密的聚集在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性结构称为包涵体。大量来不及折叠的多肽链靠疏水键结合。形成机制：折叠状态下的蛋白质聚集作用非折叠状态的蛋白质聚集作用蛋白质折叠中间体的聚集作用影响因素：温度表达水平细菌遗传性状异源蛋白氨基酸序列4．简述外源基因在大肠杆菌中的几种主要的表达方式和优缺点包涵体型异源蛋白表达1简化外源基因表达产物的分离操作-离心2能在一定程度上保持表达产物的结构稳定----蛋白酶不在构成威胁致命缺陷：丧失了原有的生物活性分泌型异源蛋白表达1目的蛋白稳定性高2目的蛋白易于分离3目的蛋白末端完整表达率通常要比包涵体方式少得多。且大肠杆菌对真核生物的蛋白质分泌机制不健全，难以表达（末端不再含有甲硫氨酸残基）融合型异源蛋白表达（N-受体蛋白-异源蛋白-C）目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离亲和层析目的蛋白表达率高一套表达元件目的蛋白溶解性好良好的空间构象目的蛋白需要回收（需要裂解和进一步分离才能获得目的蛋白，还需要回收最花成本）寡聚型异源蛋白表达目的蛋白高效表达稳定表达的小分子短肽【多拷贝外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上】目的产物回收困难（需要裂解，但容易出现裂解后的短肽序列不均一性）整合型异源蛋白表达整合到染色体DNA上目的基因稳定表达、不丢失目的基因表达率低蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建外源蛋白稳定存在需要对受体细胞进行缺陷抗性或缺陷改造5．如何从重组的融合蛋白中回收目标蛋白融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体会引起免疫反应，因此一般要除去，主要有两种方法A化学断裂法：最佳试剂→CNBr（与多肽链中甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，从而导致不稳定，在水的作用下断裂）--回收率高、专一性强、目标蛋白N端不含甲硫氨酸残基。（要求外源蛋白中不含有甲硫氨酸残基）B酶促裂解法：单残基位点：断裂效率更高，同时每种蛋白均具有相应的断裂位点决定簇，在精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键（要求外源蛋白质分子中不含有精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基，但大分子蛋白质上述三种残基出现的概率不低）多残基位点：在受体蛋白和外源蛋白之间加一段（lle-Glu-Gly-Arg）寡肽序列的人工接头片段，该寡肽片段和凝血因子Xa识别和作用，断裂点在Arg的c末端，用此法可以使得外源蛋白质不含上述寡肽链。或用肠激酶EK，在pH4.5-9.0较广范围内制动断裂6．影响外源基因在大肠杆菌中高效且活性表达的主要因素有哪些？1。DNA进入时，限制性核酸内切酶作用2。多拷贝数和表达率的权衡3。异源蛋白被蛋白酶降解4。异源蛋白被形成内涵体，变性5。异源蛋白被结合，不易分离等7．简述包涵体复性工作的原理主要任务是1将多肽链中拆开的游离巯基重新折叠2通过次级键的形成使蛋白质复性复性操作：方法1：一步稀释法，蛋白质毒性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大方法2：分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生方法3：试剂添加法，精氨酸，甘氨酸，甘油，蔗糖，PEG，Ca2+方法4：蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白质带负电，抑制聚集方法5：产物隔离法，江边形的蛋白质分子固定化，避免其互相碰撞方法6：分子伴侣法，分子伴侣专一性帮助多肽正确折叠成正确构象重折叠：适合那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质折叠→化学氧化法（A）需要还原型和氧化型谷胱甘肽，实用性较广，重折叠效果好→二硫键交换（B）9．简述大肠杆菌工程菌遗传不稳定性的主要表现形式和解决途径不稳定性表现在1结构不稳定（缺失、重拍、修饰）2分配不稳定（逃逸）不稳定主要原因：1受体细胞中含有大量限制性核酸内切酶，对外源DNA降解作用2重组分子中含有基因高效表达严重干扰细胞的正常生长3重组分子尤其是重组质粒在细胞分裂时不均匀分配导致重组DNA分子逃逸4受体细胞中的转座元件使得重组DNA片段的缺失重排。解决途径：1改进载体受体系统2施加选择压力3控制目的基因的过量表达4优化基因工程菌的培养工艺酶系用于核酸操作的酶有哪些：1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4核酸酶5核酸修饰酶限制性核酸内切酶定义：能够特异性的识别双链DNA某段特殊序列，并切割DNA双链的酶，主要存在于原核细菌中。主要作用有:1保护自身的DNA不受限制2破坏外源DNA使之迅速降解限制性核酸内切酶的命名：属名+种名+株名寄主微生物属名的头一个字母（大写）种名前两个字母（小写）II类限制性核酸内切酶特性：特异性识别特定回文序列，并在识别序列里或附近切割DNA双链。一般会产生3’-OH粘性末端（Pst1）、或5’-P粘性末端（EcoR1）、或平头末端（Pvu11）1U限制性核酸内切酶活性：在最适宜条件下反应1小时，