第三章-分子杂交与印迹技术

第三章分子杂交与印迹技术一、变性与复性（一）变性1、定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。第一节核酸分子杂交的基本原理2、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。3、变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加4、DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链阶梯式曲线5、GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3融解温度：定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。（二）复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。2、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）dCdt=K2C2（1）将（1）积分CCo11+K2Cot=（2）一半单链DNA分子复性时，（2）式中的为121211+K2Cot=Cot1/2值越大，复性速度越慢CCo（3）1K2Cot1/2=二、分子杂交•将任何具有互补核苷酸顺序的两条单链核酸分子放入同一个反应体系，两条互补链可通过复性重新缔合形成双链，这一过程成为核酸分子杂交。三、探针（一）探针的种类•基因组DNA探针•cDNA探针•RNA探针•寡核苷酸探针探针：是指带有标记物的、能与被检测的核酸片段互补的一段已知核酸片段。（二）探针的制备方法制备方法：(1)DNA重组技术(2)PCR扩增(3)化学合成合成寡核苷酸探针注意原则(1)长度（50-300bp);(2)G:C对含量40%-60%；(3)探针内避免互补；(4)避免同一碱基连续出现；(5)与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。（三）标记物1.想标记物应具备的特性：•高度灵敏性•不影响碱基配对的特异性•不影响探针分子的主要理化性质•对酶促反应活性无影响或影响不大•检测方法具有高度灵敏性和高度特异性2.标记物种类•核素标记物：32p、35s、3H•非核素标记物半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光（四）标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上酶促标记法1.切口平移法（nicktranslation)1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中2.随机引物法其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中随机引物法所具有的优点：1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µgDNA以上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记3.PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中三、影响杂交的因素1、探针分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂交效率2、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃3、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交5、核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度（2）复性速率与反应体系中核酸复杂性成反比（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性6、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉四、应用1.检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；2.用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。按待测核酸是否固定在固相支持物上分：•固-液相杂交印迹杂交原位杂交•液相杂交按照杂交分子特性分•DNA-DNA杂交•DNA-RNA杂交•蛋白质杂交第二节核酸分子杂交的方法一、Southern印迹杂交此技术由Southern1975年首先设计。被检测对象为DNA。带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程（一）待测核酸样品的制备1、裂解或破碎细胞2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段（二）待测DNA样品的电泳分离1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记（三）凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液（四）Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程1、固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性①具有较强结合核酸分子的能力②不影响与探针的杂交反应③与核酸分子结合稳定牢固④具有良好的机械性能非特异吸附少（2）常用的固相支持物①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本底低。缺点是DNA分子结合不牢固②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能力较上述两种膜低2、Southern印迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。（2）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。（3）真空转移法此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。（五）Southern杂交1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA（六）杂交结果检测1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针（七）Southern杂交在医学中的应用1、酶切图谱分析2、特定基因定性和定量3、基因突变分析4、限制性片段长度多态性的分析二、Northern印迹杂交1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNANorthern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNA三、Western印迹杂交将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。四、斑点及狭缝印迹杂交1、斑点印迹为圆形2、狭缝印迹为线状3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量五、原位杂交1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交；根据杂交物分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交。•保持组织细胞的形态•对核酸无抽提，修饰与降解作用•不改变核酸在组织细胞内的定位•不阻碍核酸与探针的杂交过程•对杂交信号无遮蔽作用•理化性质稳定2、杂交过程：（1）组织或细胞的固定理想固定液应具备：（2）组织细胞杂交前的预处理•去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质•组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体•控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落（3）探针的选择与标记•以获得最好杂交效果为依据选择探针•探针的长度一般为50~300bp,有时达1.5kb•放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长•非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察（4）杂交•杂交液体积小：10~20μl•cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃•杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜•杂交前一般将组织切片置95℃5~15分钟使DNA变性•冲洗温度一般不超过50℃（5）杂交结果检测•所用探针为核素标记,放射自显影检测•所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测六、液相杂交指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。（一）RNA酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。2、杂交过程•制备待测RNA•RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标记RNA探针•杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交•RNaseA和RNaseTI除去单链RNA•电泳分离RNA•放射自显性检测杂交结果（二）核酸酶S1保护分析法1、原理核酸酶S1在