谷胱甘肽含量测定

【实验目的】了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。【实验原理】谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoicacid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。【器材与试剂】1.实验仪器与用具研钵、高速离心机、移液管、离心管、试管、分光光度计2.实验试剂还原型谷胱甘肽标准液；偏磷酸溶液；磷酸溶液缓冲液（pH7）；二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoicacid，DTNB）溶液；蒸馏水。3.实验材料小麦叶片【实验步骤】1.标准曲线制作取7支试管，编号，按照下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以1号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。试剂（ml）试管号123456710μg/mlGSH标准液00.10.20.40.60.81.0蒸馏水2.01.91.81.61.41.21.0pH7磷酸缓冲液4.04.04.04.04.04.04.0DTNB试剂0.40.40.40.40.40.40.4GSH浓度μg/2ml012468102.提取取材后，称取0.2g样品置于研钵中，加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后，定容至6ml,8000转离心10min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。3.测定取上清液2ml，显色，操作同标准曲线。重复3次。显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度和空白对照管反应混合液的吸光度。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。4.计算GSH含量（μmol/g）=（Cx×Vt）/（FW×VS）式中，Cx为2ml样品中GSH的含量（μg）；Vt为样品提取液总体积（ml）；Vs为显色时样品液体积（ml）；FW为样品质量（g）。【实验结果】1.标准曲线试管编号1234567GSH浓度（μg/2ml）01246810吸光度值A00.0670.1340.3140.4520.5790.723以GSH浓度（μg/2ml）为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线。2.小麦叶片中GSH含量实验重复三次，测定结果如下：重复123样品质量（FW）0.2050.2040.206吸光度0.1930.1920.196Cx0.01410.01400.0143GSH含量（μmol/g）0.2060.2060.208GSH含量平均值0.207【注意事项】1.在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量。在谷胱甘肽还原酶（GR）作用下，将GSSG还原成GSH再进行测定和计算。3.建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品中本底对照和空白对照非常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。