实用指导一：慢病毒感染MOI预实验

实用指导（一）：慢病毒感染MOI预实验MOI：MultiplicityofInfection，译为感染复数，即病毒量与细胞数的比值。每种细胞对慢病毒的敏感性不同，有的容易感染，有的则比较难，同时每种慢病毒载体荧光强度也有差异，所以在正式实验前需要做病毒感染预实验来确认MOI值以达到理想的实验效果。理论上MOI值越高，慢病毒感染上的可能性越大，感染效率越高，但是这样对细胞的毒性也就越大。所以预实验确认MOI值是要在细胞成活率和感染效率中找到一个平衡点。一般如果MOI超过100，甚至200还感染不上，说明慢病毒非常难感染这株细胞，甚至感染不上，那么就要考虑换一种方式，比如腺病毒或者电转（此种情况下比较不推荐再试脂质体，一般也很难转进去）。慢病毒感染MOI预实验步骤：第一天：铺板。设置MOI梯度：可以按照不加病毒,10,20,30,50,80,100来设置MOI梯度，或者根据实际情况设置梯度都可。不加病毒组是用来判定细胞状态的。注：最好设置一组复孔。如下图：细胞接种：一般用24孔板接种2×104个细胞左右。如果细胞特别大可以适当减少，特别小可以增加。原则上以第二天汇合度达到30%-40%为宜。放入培养箱培养第二天：加病毒。按照设置好的MOI算好每孔需要加的病毒量。每孔加病毒量(μl)=MOI×细胞数/滴度(TU/ml)×1000。注：一般第二天细胞数按照倍增来算。例如：病毒滴度1×108TU/ml，接种细胞数2×104，MOI=10。那么，病毒量=10×4×104/1×108×1000=4μl加慢病毒。按照算好的病毒量吸取病毒原液加入培养基中，摇动孔板混匀。注：如果病毒滴度太高，每孔加的病毒太少，移液器量程不够可以先将病毒稀释后再加。稀释倍数根据实际情况来定，稀释液用无血清培养基、Opti-MEM、PBS都可以。加Polybrene：加完病毒的孔中再加入Polybrene，终浓度5µg/ml，摇动孔板混匀。注：Polybrene对部分细胞毒性很大(比如原代神经元，树突细胞等)，不要加。如果实在不知道应不应该加，可以增加一组预实验，只加Polybrene不加病毒，跟都不加的组对比。放入培养箱继续培养。第三天：换液提前37℃预热培养基。弃去含病毒的旧培养基，加入预热好的新鲜完全培养基。放入培养箱继续培养。第五天：观察，拍照，确定合适的MOI值在荧光显微镜下观察，并拍照。确定合适的MOI值。