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专题2微生物的培养与应用课题1微生物的实验室培养了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。一、课题目标：掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术、平板划线法等基本操作二、课题重点和难点：三、技能目标：一.微生物的类群微生物原核类:真核类非细胞类：细菌、支原体、放线菌、蓝藻个体微小、结构简单酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：显微藻类、原生动物（如：草履虫、变形虫等）病毒◆微生物的共同特点：1.细菌的形态2.细菌的菌落⑴.定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。⑵.特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。⑶.功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。几种菌落及其形态1.概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。二.培养基思考：微生物要生存繁殖，需要“吃”什么？2.培养基的营养物质1.水2.碳源（提供碳元素的物质）3.氮源（提供氮元素的物质）4.无机物（无机盐）3.培养基的类型（1）按物理状态分：固体培养基半固体培养基液体培养基区别：加入琼脂的量决定培养基的物理状态。注意：一般细菌不能利用琼脂。单个或者少数微生物在固体培养基表面生长繁殖,可以形成肉眼可见子细胞的群体——菌落固体培养基用途：用于微生物纯化、计数、鉴定液体培养基：工业生产表面生长均匀混浊生长沉淀生长半固体培养基：观察运动天然培养基合成培养基化学成分不恒定的天然有机物如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基化学成分完全了解的物质配制而成的培养基（2）按化学成分划分：鉴别培养基将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基（3）按用途划分：选择培养基和鉴别培养基的比较种类用途例子选择培养基鉴别培养基从众多微生物中分离所需的微生物鉴别不同种类的微生物不加含碳有机物的无碳培养基，伊红—美篮培养基使大肠杆菌的菌落呈黑色，可以鉴别大肠杆菌分离自养型微生物2.无菌范围：实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验操作过程3.无菌的方法：酒精灯旁操作三.无菌技术防止外来杂菌的污染1.无菌的意义：消毒与灭菌（1）消毒（2）灭菌概念较为温和理化方法杀死部分有害微生物强烈的理化因素杀死所有的微生物2.无菌的方法接种室内空气、接种箱、超净工作台紫外线消毒实验者的手臂、实验台等化学药剂消毒牛奶等不宜高温消毒灭菌的巴氏消毒日常食物、罐装食品煮沸消毒法适用范围方法（1）消毒培养基、实验器材高压蒸汽灭菌耐高温需干燥的物品（玻璃器皿等）干热灭菌接种的工具、试管口、瓶口灼烧灭菌适用对象灭菌方法灼烧灭菌干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅（2）灭菌请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻璃棒、试管、烧瓶（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。我们已经对培养基和无菌技术有了一定的了解，你能不能用培养基进行大肠杆菌的纯化培养？大肠杆菌的纯化培养：（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基四.实验操作（二）纯化大肠杆菌1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g1.计算：依配方计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂、搅拌→补水定容4.灭菌：5.倒平板：（一）制备培养基培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌计算称量溶化灭菌倒平板（一）制备培养基1.将培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。12342.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。3.用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20mL)倒入培养皿，左手立即盖上皿盖。4.等待平板冷却凝固（约需5～10min）。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：①防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染②避免培养基中水分过快蒸发。答：最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。单个细胞单个菌落（二）纯化大肠杆菌如何纯化？接种常见方法平板划线法如何分散成单个细胞？稀释涂布平板法微生物群分散1.平板划线法：分区划线法连续划线法（1）概念与原理：聚集的菌群连续划线稀释分散单个细胞菌落生长繁殖(2)“平板划线”实验操作（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者接种结束后杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞每次划线前杀死接种环上原有微生物取菌种前目的灼烧时期（2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。（3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到单个细菌繁殖而来的菌落。3个划线平板1个不划线平板（重复实验）（空白对照）（3）培养放入37℃恒温箱中培养12h～24h2.稀释涂布平板法①菌液的梯度稀释：②涂布平板操作：(1)概念与原理：聚集的微生物单个细胞菌液梯度稀释菌落涂布平板(2)操作：生长繁殖①系列梯度稀释操作9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水9mL无菌水注意：移液管需要经过灭菌；试管口和移液管离火焰1～2cm处。②涂布平板操作：各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照稀释103倍稀释104倍稀释105倍放入37℃恒温箱中培养12h～24h（3）培养1.临时保藏：试管固体斜面培养基上4℃2.长期保存：菌种易被污染、变异甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃三菌种的保存3～6个月，转移培养•2．分析下面培养基的配方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答：•(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是________和________。•(2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？•________________________________________________________________________。•有选择作用。因为此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长葡萄糖尿素3.培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是()①化学消毒②灼烧灭菌③干热灭菌④紫外线灭菌⑤高压蒸汽灭菌⑥巴氏消毒法A．⑤③②①④⑥B．①②③④⑤⑥C．⑥②③④①⑤D．③④②①⑥⑤A四成果评价如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。（一）培养基的制作是否合格（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。液体培养基：工业生产表面生长均匀混浊生长沉淀生长固体培养基用途：用于微生物纯化、计数、鉴定半固体培养基：观察运动