第03章_培养基灭菌及设备

第3章培养基灭菌及设备第1节灭菌的基本理论一、常用的灭菌方法1、化学药剂灭菌甲醛、次氯酸钠、高锰酸钾、苯酚、环氧乙烷等。2、射线灭菌紫外线、gama射线、X射线等3、干热灭菌160℃～250℃干燥保温。用于须保持干燥的器具和材料。4、湿热灭菌高压饱和蒸汽。通常120℃维持20～30min。5、过滤除菌二、微生物的热死及耐热性（一）湿热灭菌的原理每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。（二）微生物的耐热性1、1/10衰减时间按何热死速度常数2、热死时间3、热死温度4、热阻及相对热阻三、培养基的灭菌（一）培养基湿热灭菌需解决的工程问题（1）将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。（2）灭菌温度和时间的确定取决于：——①杂菌孢子的热灭死动力学——②反应器的形式和操作方式——③培养基中有效成分受热破坏的可接受范围（二）微生物的热死灭动力学方程1、对数残留定律对数残留定律：实验证明，对培养基进行湿热灭菌时，培养基中微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比。即微生物营养细胞的均相热死灭菌动力学符合化学反应的一级反应动力学。即：N：任一时刻的活细菌浓度（个/L）t：时间（s）K：比热死速率常数（s-1）NKddN取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得或N/N0即为湿热灭菌中微生物的存活率。KNN0lnNNKτ0ln12、耐热细菌芽孢的热死模型菌体相继死亡模型：NR→NS→ND热死动力学方程：τ)]K(KKτ)(K[KKKNNRRsssRRexpexp0（三）温度对死亡速率的影响微生物的热死亡动力学接近一级反应动力学，它的比热死亡速率常数K与灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程表征：A：频率因子（s-1）ΔE：死亡活化能（J/mol）R：通用气体常数[8.314J/（mol.k）]T：热力学温度（K）RTEeAK/上式转换：RTElnAKln可以看出：（1）活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件相同时，ΔE越高，K越低，热死速率越慢。（2）不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。将ΔE/R作为微生物受热死亡时对温度敏感性的度量。培养基中的某些营养物质也会受热破坏，其反应动力学方程也可看作一级反应：CKddCd对方程两边对T取导数，得方程：RTElnAKlnREdTKdln由方程可得出结论：反应的ΔE越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大试验表明，细菌孢子热死灭反应的ΔE很高，而某些有效成分热破坏反应的ΔE较低。将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的ΔE很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少。四、影响培养湿热灭菌的因素（1）pH：影响微生物的耐热性。一般，pH6.0~8.0时，微生物最不容易死亡。（2）培养基成分：油脂、糖类及一定浓度的蛋白质都回增加微生物的耐热性；高浓度的盐类、色素则会削弱其耐热性。（3）气泡：影响传热。（4）颗粒：大颗粒（1mm以上）的传热系数很低，使灭菌不彻底。第2节培养基灭菌的工程设计一、灭菌对象和无菌标准灭菌对象：应选择耐热杆菌芽孢无菌标准：常取N=NS=10-3二、发酵罐的管道与阀门（一）管道的连接方式螺纹连接：上下水管焊接：物料、蒸汽、腐蚀性介质输送管道法兰连接：需经常维修或易燃易爆车间的管道承插连接：铸铁水管（二）用于发酵罐的阀门发酵罐常用的阀门种类：人工启闭：截止阀、闸门阀、针形阀、橡皮隔膜阀自动启闭：止逆阀、安全阀自动控制：电磁阀（一）分批灭菌的操作分批灭菌（间歇灭菌、实罐灭菌、实消）将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将培养基和所用的设备（一般是发酵罐）一起进行灭菌，也称实罐灭菌。这种方法不需专门的灭菌设备，在发酵罐中进行，灭菌效果可靠。分批灭菌对蒸汽的压力要求较低，在3～4×105Pa（表压）就可满足要求，但在灭菌过程中，蒸汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。三、分批灭菌的设计计算分批灭菌的优缺点优点：1.设备投资较少2.染菌的危险性较小3.人工操作较方便4.对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。保证分批灭菌成功的要素内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象压力稳定的蒸汽合理的操作方法。发酵罐的接管图（二）基础条件的确定1、污染度N0：一般假定位104～106个/ml2、灭菌度N：实际计算时取N＝10-3，即处理1000只有一个或微生物（一般是针对周期长，成本高的发酵）。3、N/N0为灭菌程度的指标。例如：培养基100m3，含菌105个/ml,，要求灭菌后存活菌数10-3个/罐，则N0/N=(100×106×105/10-3)=1016，为计算方便，取ln(N0/N)=36.8分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。lnN0/N=36.8是总的判据，是由升温、保温、降温三段实现的。4、污染菌的热死特性要了解是否符合对数残留定律，确定K，A，E的值。对不同细胞，选取不同的T和t。5、培养罐中温度与时间的关系大量培养液分批灭菌时，加热和冷却时间不能忽略。总灭菌时间等于升温、保温和降温三段时间之和。t=t1+t2+t3（三）灭菌效率的计算1、分批灭菌的阶段若灭菌温度恒定为T，那么到规定灭菌度（N）所需杀菌时间当灭菌℃随时间变化时，K也变化，则有积分)/lg(303.2)/ln(100SSNNKNNKtNAeKNdtdNRTE.//tRTESdteANN0/0)/ln(用V表示灭菌效果，则有V总＝ln(N0/NS)=V加+V保+V冷升温、维持和冷却过程中灭菌效果分别为3210/3202/210/10)/ln()/ln()/ln(tRTEtTRTEtRTEdteANNtKdteANNdteANNV加V保V冷[例题1]工业规模的灭菌操作，完成整个灭菌周期的时间是3~5h，各阶段的贡献大致如下：V加/V总=0.2V保/V总=0.75V冷/V总=0.05（四）分批灭菌的讨论温度和压力的关系泡沫问题投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上残留的问题灭菌结束后应立即引入无菌空气保压培养基间歇灭菌过程中应注意的问题（一）连续灭菌概念（二）连续灭菌流程（三）连续灭菌计算四、连续灭菌的设计计算（一）连续灭菌概念连续灭菌（连消）：培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却，然后进入发酵罐的杀菌方法。连续灭菌的优缺点：优点–保留较多的营养质量–容易放大–较易自动控制；–糖受蒸汽的影响较少；–缩短灭菌周期；–在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；–发酵罐利用率高；–蒸汽负荷均匀。缺点–设备比较复杂，投资较大，容易造成污染。1、喷淋冷却连续灭菌流程（二）连续灭菌流程设备：配料罐、连消泵、连消塔、维持罐、蛇管冷却器等。特点：设备庞大，易发生局部受热不均。流程：配料→调浆缸放出→加消泡剂→连消泵→连消塔→料液加热→维持罐（8～25min）→喷淋器冷却到发酵温度2、喷射加热连续灭菌流程设备：蒸汽喷射加热器、保温蛇管、膨胀阀、真空冷却器等流程：蒸汽直接喷入培养液→快速升温灭菌度→保温灭菌→膨胀降压→真空冷却器急速冷却特点：受热时间短，培养液破坏低，灭菌效果好。典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图3、薄板换热器连续灭菌流程培养基在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程。薄板换热器连续灭菌流程薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图1、连续灭菌设备的结构套管式连消塔喷嘴式连消塔（三）连续灭菌计算维持罐喷射加热器直接蒸汽连续灭菌设备温度和时间的关系：由于加热和冷却时间极短，可省略。灭菌时间主要是维持器中停留时间，故只有维持器的设计与灭菌程度有关。已知灭菌温度，理论灭菌时间可按下式估算：杀菌速率常数K可取普通耐热细菌芽孢的K值，并按下式计算：)/lg(303.2)/ln(100SSNNKNNKtTeXK98.1/68700381094.72、连续灭菌时间的计算维持管长度与管内流体流动状态、传热效率等因素有关。计算方法自学。3、维持管长度的计算练习1、名词解释灭菌比热死亡速率常数1/10衰减时间分批灭菌连续灭菌返混现象活塞流反应器全混流模型2、问答（1）从理论上分析，连续灭菌和分批灭菌何者更优？（2）影响培养基湿热灭菌的因素有哪些？