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1水产动物疾病学实验指导王文彬编湖南文理学院生命科学学院二〇〇八年十一月2目录实验1常见渔用药物的识别及给药方法………………………………1实验2渔用氯制消毒剂有效氯的测定…………………………………4实验3水产动物常见病原体标本的观察………………………………7实验4鱼用土法疫苗的制作及使用……………………………………9实验5鱼病的系统检查与诊断…………………………………………11实习指导………………………………………………………………………133实验1.常用渔药的识别及给药方法一、实验目的1.识别常用渔药，了解并掌握各种药品的主要特性与基本用途；2.训练渔药的正确使用方法；3.通过给药方法的操作训练，培养学生实验动手能力。二、实验内容1.常用渔药的识别；2.操作给药方法——注射法和药浴法；3.鱼苗、鱼种对几种常用渔药的毒性及忍受力试验（有兴趣的同学选做）。三、材料与仪器用品1.实验材料：活的鱼苗鱼种（鲤、鲫或黄颡鱼、黄鳝）。常用渔药：聚维酮碘（PVP-I）、氯霉素、土霉素、（复方）新诺明、诺氟沙星、漂白粉、漂粉精、强氯精、防消散、优氯净、氯胺-T、晶体敌百虫、福尔马林、高锰酸钾、硫酸铜、硫酸亚铁、硫双二氯酚（别丁）、孔雀石绿、亚甲基蓝、沸石、呋喃唑酮（痢特灵）等。2.实验用品：水族箱、搪瓷脸盆、瓷碗、烧杯、量筒、注射器、玻璃皿，吸管，吸水纸等。四、实验原理与方法（一）渔药的种类药物是指对机体产生某种生理生化影响，并在疾病的治疗、预防和诊断方面有一定效果的化学物质。渔药(fisherydrugs)的种类从现有资料看，国内外大致有300种以上。NelsonHerwig（1979）收载了276种，不包括某些改善机体代谢技能的促生长药和饲料添加剂等。按药物的作用对象，并结合其他形式可将渔药分为以下十大类：1.抗病毒药：如聚乙烯吡咯烷酮碘（PVP-I）、免疫制剂等。2.抗细菌药：如抗菌素、磺胺类、呋喃类、抗菌中草药等。3.杀真菌剂：如孔雀绿、亚甲基蓝、制霉菌素等。4.杀藻类药：如生石灰、硫酸铜等。5.消毒防腐剂：醛类：福尔马林；氧化剂：高锰酸钾；卤素类：漂白粉、次氯酸钙（漂粉精）、三氯异氰尿酸（强氯精、鱼安）、二氯异氰尿酸（防消散）、二氯异氰尿酸钠（优氯净）、氯胺-T；染料类：孔雀石绿、亚甲基蓝、吖啶黄；4表面活性剂：新洁尔灭等。6.杀虫驱虫药：如敌百虫、硫酸铜、硫双二氯酚、过氧化焦磷酸钠等。7.环境改良剂：如生石灰、过氧化钙、沸石等。8.营养及代谢改善剂：如维生素、激素等。9.麻醉剂：如间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS222）等。10.抗霉抗氧化剂：如乙氧基喹宁等。渔药选择的原则：①疗效高（有效性）；②毒性低（安全性）；③使用方便（方便性）；④价格便宜（廉价性）。★识别以上常用的渔物。（二）渔药的使用方法1.遍洒法（全池泼洒法）：疾病防治中最常使用的一种方法。使用时，首先要准确测量池塘水体，计算药量，之后，称取药物用水溶解后均匀地泼到全池中去。此法适用于中、小型水体，施药方便，能较彻底地杀死养殖动物身上及其生活水体中的病原生物。但用药量大，且能杀死水体中的饵料生物，对环境也有一定污染。★计算池塘水体的体积和施放漂白粉的药量。2.悬挂法：漂白粉挂篓，硫酸铜、敌百虫挂袋，在食场周围形成一消毒区，利用水产动物摄食时杀灭病原体。此法具有用药少、简便、副作用少等优点，但杀灭病原体不彻底，只适用于预防和早期治疗。一般需持续挂药三天。3.浸洗法（药浴法）：在较小的容器内，配置一定浓度的药液，将患病水产动物放入其中进行短时间浸泡，以消灭寄生于体表的病原体。此法经常被用于转池及运输前后的苗种消毒。4.口服法：即将药物与水产动物喜吃的饲料一起拌以黏合剂，制成适口的药饵投喂，而达到杀灭体内病原体的方法。适用于预防和治疗疾病，但当病情严重时，患病动物已失去食欲，停止摄食或摄食不多时，则不能用。口服药饵的制作方法一般有以下几种：（1）药面：将药物、饵料（糠饼、麦麸、豆饼或菜饼）和黏合剂（榆树粉、面粉、红薯粉等），按适当的比例混和调匀后，做成适口的条状、颗粒状，晾干后投喂。（2）药物草料：将药物混和在黏合剂中加热水调成糊状，再黏附于青草上投喂。（3）药物米糠：将药物混和在黏合剂中加热水调成糊状，拌入米糠做成薄饼投喂。（4）新鲜肉质药饵：将药物混和于黏合剂中搅匀，再把药糊涂在肉质饵料上投喂。（5）混药：在饲料中加入药物，放入适量的水拌匀，直接投到食台上喂养。5.涂抹法：在体表患处涂抹较浓的药液以杀灭病原体。适用于产卵亲体检查和注射催产剂时。注意涂抹时，头部一定要朝上，以防药液流入鳃。6.浸沤法：应用中草药防治疾病时采用的方法，将捆扎好的中草药放在鱼池上风处，渗出药汁杀灭水体及水产动物体表的病原体。7.注射法：有两种类型，一类是给放养鱼种注射疫苗，另一类是给已患病的个体注射抗菌素等5治疗药物。方式有肌肉注射和腹腔注射两种。此法费时费力，一般只用于亲本及名贵水产动物苗种的疾病防治。★用鲫鱼或鲤鱼操作注射法。8.口灌法：采用注射器(针尖套一软管)将药液向水产动物的口腔或食道深部灌入。渔药剂量原则：内用药按体重（患病与未生病的水产动物体重）计；外用药按水体体积计，即总用药量（g）=水体体积（m3）×药物浓度（g/m3）。（三）鱼苗、鱼种对几种常用渔药的毒性及耐受力试验1.试验材料：试验用鱼为黄鳝（或其它鱼）鱼种。试验容器为31.5×23.5×11cm方形白色塑料箱，每箱盛药液5L，试验用水为曝气72h的自来水。用于试验的药物为3～6种外用消毒灭菌杀虫药物，如高锰酸钾、硫酸铜和晶体敌百虫等。试验前先将药品配成母液，再根据实际用量吸取母液放入试验水族箱。2.试验方法：试验前，先根据有关资料确定某种药物的浸浴浓度（5～11个浓度），或先按适当比例从低浓度到高浓度进行48h预备试验。根据试验结果确定试验浓度范围，按等对数间距设置5个浓度组及1个对照组，另外每个组设两个重复。试验期间增氧、不投饵，前8h作连续观察，不换液或24h换1次试验液（某些药物）。试验时，设对照组作比较，每组试验用10～20尾鱼，记录24h、48h及96h各水族箱中鱼的死亡尾数和中毒症状，计算死亡率。在前8h对试验鱼作连续观察，并作24、48、96h的定时观察，做好供试鱼的存活记录，对96h未显毒性症状的试验鱼继续观察。根据用药浓度、死亡时间和死亡率，★利用半对数座标用直线内插法求出中间忍受限度或半数致死浓度(LC50)。★或者，按照寇氏法（Karber），计算半数致死浓度(LC50)：LogLC50=XM–d(∑p-0.5)式中XM为死亡组最大剂量的对数,d为相邻组浓度对数差,p为各组的死亡率，Σp为各组死亡率的总和。查反对数表求LC50，并按特伦堡（Turabell）公式：Sc=0.3×48hLC50／(24hLC50/48hLC50)2或按经验公式：Sc=96hLC50×0.1求出安全浓度（Sc）。作业：通过试验或以下实例，计算出所用试验鱼种对几种常用渔药的安全浓度。实例：黄颡鱼苗对3种渔药的耐受力（急性毒性）试验6表1各试验液的药物质量浓度（mg/L）药品试验组对照组ⅠⅡⅢⅣⅤ亚基蓝40.049.060.073.590.00次氯酸钠2.73.54.66.07.80硫酸铜+硫酸亚铁合剂1.62.64.16.510.40注：当实验药物的浓度已经远高于常用量而仍旧不死鱼时，则仅对被测的最高浓度作出评价。表2三种药物对黄颡鱼苗的半致死浓度和安全浓度药物浓度/mg﹒L-1死亡率/%LC50/mg﹒L-1安全浓度/mg﹒L-124h48h96h24h48h96h亚基蓝40.00103049.00305060.00458073.520759590.040100100次氯酸钠2.700103.5010204.6015356.01030607.8255085硫酸铜+硫酸亚铁合剂1.61520302.63035604.14055906.5859510010.4100100100请按寇氏法公式，计算出24h、48h、96h的半数致死浓度(LC50)，再按特伦堡公式计算出三种药物的安全质量浓度，结果均填入表中。7实验2.渔用氯制消毒剂有效氯的测定一、实验目的1.了解渔用氯制消毒剂种类及其有效氯的标准含量；2.掌握漂白粉等氯制剂有效氯含量的测定方法。二、实验内容1.认识常用的渔用氯制消毒剂的种类，了解其有效氯的标准含量；2.采用碘量法、维生素C法、蓝黑墨水滴定法等，分别测定漂白粉、优氯净等氯制剂有效氯的含量。三、材料与仪器用品1.漂白粉、精制淀粉（配制：将可溶性淀粉加无水酒精润湿，研磨2h，烘干而成）、碘化钾晶体、维生素C（含量100mg/片）、蓝黑墨水、醋酸、0.1mol/L硫代硫酸钠液、稀盐酸、蒸馏水。2.电子天平、研钵、玻璃棒、500ml容量瓶、量筒、移液管、吸管、大小烧杯、白瓷碗。四、实验原理与方法（一）渔用氯制消毒剂种类及其有效氯的标准含量氯制消毒剂药物主要用于鱼、虾类体表或环境消毒，没有严格的抗菌谱，对微生物与机体间也无明显的选择作用，只存在差异，是一类较能迅速杀灭微生物的药物。其杀灭机理是氧化细菌原浆蛋白中的活性基团，并和蛋白质的氨基结合而使其变性。渔用氯制消毒剂药品主要有6种（见表1）。表1渔用氯制消毒剂的种类及其有效氯的标准含量名称化学名分子式性状有效氯的标准含量漂白粉含氯石灰Ca(ClO)2+CaCl2+CaO+Ca(OH)2白色颗粒状粉末，有氯臭一般含25～35%漂粉精次氯酸钙Ca(ClO)2白色粉末，有氯臭60～70%或80～85%氯胺-T别名：氯亚明甲苯磺酰氯胺钠C7H7O2NClSNa·3H2O白色微黄晶粉24～26%优氯净二氯异氰尿酸钠C3O3N3Cl2Na白色晶粉，有浓氯气味原粉60～64%防消散二氯异氰尿酸C3HO3N3Cl2白色粉末，有氯臭原粉71%强氯精三氯异氰尿酸C3O3N3Cl3白色粉末，有氯臭原粉约90%（二）漂白粉的鉴别和有效氯含量的测定方法漂白粉是水产药物中一种廉价和广泛使用的强力杀菌剂和消毒剂。药浴和泼洒均很方便，能8预防和治疗多种微生物引起的疾病。但是，漂白粉在空气中容易潮解而失去有效氯，受日光作用也迅速分解，对金属有腐蚀作用，故必须盛放在密闭陶器内，存放于阴冷干燥处。如保管不善，会造成失效。用这种有效成分减少或已完全失效的漂白粉，按正常用量拿来使用，就会对疾病无治疗效果。1.漂白粉的鉴别方法：本品遇稀盐酸，即产生大量的氯气。2.漂白粉有效氯含量的测定方法：（1）碘量法称取漂白粉2g，置研钵中，分次加水25ml，研磨调匀，移置500ml的容量瓶中，并将研钵用水洗净，洗液并入容量瓶中。然后，用蒸馏水稀释至刻度，密塞，静置10min；摇匀，准确量取混悬液100ml，加碘化钾1g与醋酸5ml，用硫代硫酸钠液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，即得漂白粉有效氯含量（每1ml的0.1mol/L硫代硫酸钠溶液相当于3.546mg的氯）。（2）维生素C法①取含量100mg维生素C1片，压成粉状，加入15~20ml清洁水中使其溶解。②加碘化钾晶体2小匙（约200mg）和精制淀粉2小匙至维生素C溶液内。③用吸管吸取欲测定的1%漂白粉溶液，滴入上述溶液内，边滴入边搅动，至出现蓝色1分钟不褪色为止。记录用去1%漂白粉溶液的毫升数，代入下列简化公式：漂白粉有效氯含量（%）=400/用去1%漂白粉溶液毫升数例如，用去１％漂白粉溶液20ml，代入公式，400/20=20，即该漂白粉有效氯含量为20%。（3）蓝黑墨水滴定法①取瓶内上、中、下的漂白粉混匀，称量5g，用水（不含氯的干净水）将漂白粉混和研碎，稀释到100ml，充分搅拌后，静置。②待溶液澄清后，用移液管或注射器吸取一定量的上清液，一滴一滴地滴入白瓷碗内，共38滴（不能多，也不能少），记下用去的毫升数，再用38滴除以用量，得出每滴溶液用去的毫升数。③将上面用过的移液管或注射器洗净擦干，吸取少量墨水在管内转动后弃掉（避免管壁上存留的少许水分，使墨水浓度变稀）。然后再吸取一定量的墨水向碗中的漂白粉进行滴