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无菌药品生产管理与质量控制2014年10月20目录无菌保证与无菌生产湿热灭菌工艺的管理除菌过滤工艺制药用水的管理GMP检查中存在的问题无菌保证与无菌生产一、自然界常见的微生物种类基本特点细菌0.5~5μm，生长态时不耐热，部分能形成耐热芽孢。真菌5μm~50μm，形成芽孢随空气扩散，不耐热。病毒小于0.1μm，一般不耐热，0.22μm过滤不了。二、微生物分布特点1、微生物无处不在。2、气源性微生物革兰氏阳性菌较多：它们可形成芽孢，难以杀灭。因此，需要洁净的环境。可以通过氧化（消毒）方法除去。3、水源性的则革兰氏阴性菌多，不会形成孢子，但会形成细菌内毒素，耐热性差。通过加热，让其凝固，从而除掉。（1）、细菌内毒素和热原的概念：热原的污染是注射用原料及制剂生产普遍存在的问题，污染可能来源于原料、水、试剂、车间环境、设备等。含有热原的药品进入人体后，会使人体发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心呕吐等不良反应。严重着出现昏迷、虚脱甚至生命危险。引起热原反应的主要是革兰氏阴性菌细胞壁中降解的脂多糖，也称细菌内毒素。（2）、污染热原的途径：溶剂（注射用水）。从原辅料中带入（胰岛素，葡萄糖等）。从容器、用具、管道和装置带入。制备过程中的污染（操作时间长，装备不密封，人员操作不当）。（3）内毒素控制的方法：来源控制，控制物料、器具存放过程中的条件，减少微生物滋生。通过清洗、灭菌降低微生物负荷，减少内毒素生成。通过干热去除或者其他手段对已存在的内毒素进行破坏和去除。（4）、内毒素的去除方法：加热法。酸碱法（玻璃容器）。蒸馏法（注射用水）。活性炭吸附。超滤（中药注射剂）。离子交换法（缓冲液）。4、芽孢：当目些细菌遇到不良生存环境时，为保护自身，在细胞内形成一个壁厚而坚硬的休眠体，该休眠体及称芽孢或者孢子。由于其对不良环境的耐受性远高于生长态细胞，常被用于挑战性灭菌工艺，以确认被灭菌物品无菌的可靠性。芽孢的特点：80℃以下长期存活；100℃以下有相当高的存活率；100℃以上死亡过程符合一级动力学方程5、空气中的微生物污染：（1）、空气中的微生物为革兰氏阳性菌，他们有可能形成芽孢使其耐热性增大；严重的是，一旦被尘埃包裹，耐热性比单独存在状态上升一个数量级。（2）、为防止空气中耐热菌污染生产系统，需要将已清洁/已灭菌的容器具等置于局部单向流之下。无菌药品进化空调系统的设置及洁净区环境的建立和维持，是的有效控制微粒的同时，也在很大程度上自然的消除了尘埃粒子包藏芽孢，造成难以灭菌的风险。6、工艺用水微生物的污染（1）、水是注射剂的主要原料，水还是用于清洁与产品相接触的容器、密封材料、药液过滤器和其他配液设备等的清洁剂，因此，必须有效的控制水系统的微生物污染水平，并同时控制细菌内毒素的水平。（2）水源性的微生物多数为革兰氏阴性菌，不会形成芽孢，不耐热。外壁的主要成分为脂多糖（细菌内毒素的主要成分），其代谢产物及细胞的尸体均属细菌内毒素的污染源，即使通过灭菌的方式将革兰氏阴性菌杀灭，但不能消除细菌内毒素对无菌药品质量的影响。三、无菌保证工艺1、无菌的标准及概念：每批产品中，污染品的概率不得超过百万分之一（即产品的无菌保证值为6）.2、无菌保证工艺：使产品达到规定的无菌保证水平的工艺过程。分为两类:最终灭菌工艺和非最终灭菌工艺。（1）、非最终灭菌工艺：指在无菌环境下通过无菌操作生产无菌产品的方法。具体就是将组成药品的原料和包装材料分别灭菌或经除菌处理，在无菌条件下降其组装成成品的工艺。（2）、最终灭菌工艺：将完成最终密封的产品进行灭菌，以杀灭产品种微生物的的工艺。由此生产的无菌制剂称为最终灭菌。无菌药品。（SAL＜10-6）3、灭菌的基本原理：使细胞内的蛋白质或核酸发生不可逆的凝固或破坏，使微生物死亡。符合一级动力学方程,即：lgN=lgN0-ktN产品内微生物的残留数N0灭菌开始时产品内的微生物数t累计灭菌时间k常数，与微生物的耐热性、灭菌温度有关4、微生物的耐热参数微生物的耐热参数，简称D值，是指在特定灭菌条件下，使微生物数量下降一个对数单位或杀灭90%所用的时间（分钟）。5、灭菌率：表示不同灭菌温度所对应的灭菌效果的重要函数。灭菌温度为T℃时的灭菌效果，与121℃下同样灭菌时间的灭菌效果用下面公式表示灭菌率L=10（T-121）/Z;右图给出湿热灭菌，以121℃为标准灭菌时间，Z=10℃时灭菌率。所以，121℃灭菌1min对微生物的杀灭效果，相当于110℃灭菌12.5min的杀灭效果，100℃则需要125min。灭菌温度灭菌率L1000.0081100.081120.1261150.2511160.3161180.5011200.7941211.0001221.251231.596、标准灭菌时间：标准灭菌时间，即F0值是指在121℃下的灭菌时间，他的意义在于将不同灭菌温度下的灭菌工艺，按照灭菌效果等效的原则，换算为121℃下灭菌所需要的时间。即：F0=L*tF0标准灭菌时间L特定灭菌温度下的灭菌率t灭菌时间例：110℃灭菌30minF0值计算：110℃的灭菌率为0.08，F0=0.08*30=2.4min，即110℃灭菌30min相当于121℃灭菌2.4min。F0值是衡量、区分无菌保证工艺属于最终灭菌工艺还是非最终灭菌工艺。7、无菌保证水平：公式SAL=F0/D-lgN0药典规定，最终灭菌工艺生产的药品SAL=10-6，残存微生物的概率越低，无菌保证的风险越低。所以,无菌保证水平必须有足够的F0值，控制产品灭菌前的微生物。例：假定灭菌开始时产品中的污染微生物总数（N0）为100cfu/瓶，耐热参数（D）为1min，要达到无菌保证水平不小于6的标准，灭菌F0=SAL+lgNO*D=(6+lg100)*1=8min.同样的产品，在110℃下灭菌，则灭菌时间为：t=F0/L110=8/0.08=100min。8、残存概率灭菌法与过度杀灭法：（1）、残存概率法，灭菌过程8≤F0≤12min，适用于热稳定不好的产品，需要通过控制工艺过程的微生物污染和灭菌工艺参数，而不能仅依赖于最终灭菌过程杀死污染微生物，使无菌保证值不小于6.（2）、过度杀灭法：生物负荷及其D值均可能不同，将其杀灭到106后，在使其存活概率下降6个对数单位，其F0值≥12min，适用于热稳定性很好的产品，即使不考虑产品灭菌前的污染情况，也能够保证无菌保证水平≤10-6.（3）、灭菌方法的选择：1）灭菌条件121℃，15min湿热灭菌。2）灭菌F0值≥8min，SAL≤10-6的湿热灭菌。3）采用微生物截留过滤器的除菌过滤工艺。4）采用无菌原料和预先灭菌的包装材料进行无菌配制和灌装工艺。灭菌工艺决策树湿热灭菌工艺一、蒸汽：在一定温度下，不同加热介质（灭菌蒸汽）的热能有很大的差别。过热水、饱和蒸汽和蒸汽-空气混合物含有不同的热能。1、湿热灭菌采用的蒸汽包括工业蒸汽和纯蒸汽，二者使用的场合不同。工业蒸汽一般不与药液过滤器、灌装机部件类被灭菌品直接接触，只用于转移能量的目的。它可用于脉动真空灭菌器的夹套加热。一般较常见的情况是工业蒸汽用于小容量注射剂（安瓿瓶）的最终灭菌，然而，应当意识到，少数安瓿瓶可能存在密封性缺陷，微量的工业蒸汽有可能进入这类有缺陷的安瓿瓶，且在捡漏整很难发现，会带来一定的风险。纯蒸汽：由于灌装部件、过滤器等直接与产品接触，灭菌腔室内的蒸汽应采用纯蒸汽。2、湿热灭菌器常见湿热灭菌器包括脉动真空灭菌器（或称预真空灭菌器）、蒸汽-空气混合物灭菌器和过热水灭菌器等。脉动真空灭菌器脉动真空式蒸汽灭菌器是药品生产中所采用的最典型的高压蒸汽灭菌器，通常由灭菌腔体、密封门、控制系统、管路系统等组成，并连接压缩空气、蒸汽/纯蒸汽、真空泵等。在灭菌阶段开始之前通过真空泵或其他系统将空气从腔室移除，然后通入饱和蒸汽，反复进行真空、通入蒸汽，将空气彻底置换后进行灭菌。灭菌器设有真空系统和空气过滤系统。灭菌程序由计算机控制完成，腔体内冷空气排除比较彻底；具有灭菌周期短、效率高等特点。脉动真空式蒸汽灭菌器对物品包装、放置要求较宽，且真空状态下物品不易氧化损坏的特点，常用于对空气难以去除的多孔/坚硬装载进行灭菌，尤其适用于可以包藏或夹带空气的装载物，比如软管、过滤器和灌装机部件。3、脉动真空灭菌柜灭菌原理4、湿热灭菌的特点：蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活，从而杀死细胞。蒸汽热穿透性强。灭菌效率高：温度相对较低，灭菌时间相对较短。灭菌过程不产生任何化学物理污染：释放热量，凝结成水。灭菌过程控制参数少（时间、温度及压力），运行稳定，方便管理。5、湿热灭菌过程需注意的事项（1）、应当定期对灭菌柜腔室做检漏测试（灭菌过程需抽真空）。（2）、除以密封的产品外，被灭菌物体应当用合适的材料适当包扎，所用材料及包扎方式应当有：a、有利于空气排放b、蒸汽能够穿透c、灭菌后能够防止二次污染二、湿热灭菌的验证1、灭菌工艺验证包括：1）灭菌设备的安装确认。2）灭菌设备的运行确认。3）灭菌工艺验证。4）对设备温度仪表和验证用仪器进行校验。5）空载热分布-找到灭菌过程中灭菌设备的最冷点。6）不同装载形式、不同装量规格产品的热穿透试验，及产品的F0值。a、最大和最小装载条件下的热穿透试验，其目的是获取不同未知的产品在灭菌过程中实际达到的温度和F0值，从而了解不同位置的产品之间，以及与日常生产运行时灭菌设备记录的温度和F0值之间的差异。b、应至少进行最大和最小装载条件下的热穿透试验。有多种装量规格的产品时，应至少分别进行最小和最大装量规格产品的热穿透试验。7）微生物挑战性试验。a、通过微生物挑战性试验应能证明拟定的灭菌工艺参数允许的最差灭菌条件下，通过该灭菌工艺能将符合的预定的灭菌前污染微生物数量和耐热性限度的产品中的微生物杀灭至存活概率不得超过百万分之一。b、对于最终灭菌F0值小于12min的灭菌工艺（即残存概率灭菌工艺），应进行微生物挑战性试验。除菌过滤工艺一、除菌过滤的原理：利用孔径0.22μm的拦截去除直径在0.3μm处呈正态分布的细菌。1、达到除菌过滤的条件：具有适当孔径的除菌过滤器，应始终能去除被加工产品中的所有微生物，获得无菌的药液，这类孔径经常为0.2μm或者更小。2、截留：足够小的能够进入过滤矩阵整的颗粒或微生物通过吸附螯合作用被捕获。影响参数：a、过滤器的表面化学性质b、溶液的性质c、颗粒或者微生物d、过滤条件举例：0.02μm病毒去除0.2/0.22μm除菌过滤0.45μm微生物负载的减少大于3μm颗粒去除3、除菌过滤器在细菌保留方面的定义:在工艺条件下，每平方厘米的有效过滤面积中，能够保留107cfu个缺陷假单胞菌的过滤器。4、除菌过滤器的设置两只串联过滤器第一只为截留药液中的细菌的负载，第二只接近灌装点，满足无菌保证要求。因分险高的原因，第二只过滤器完整性测试合格，产品及可放行。看下面两个图：5、除菌过滤的法规要求：《药品生产质量管理规范》2010修订版：附录1：无菌药品第十章生产管理第五十七条应尽可能缩短包装材料、容器和设备的清洗、干燥和灭菌的间隔时间以及灭菌至使用的间隔时间。应建立规定贮存条件下的时限控制标准。第五十八条应尽可能缩短药液从开始配制到灭菌（或除菌过滤）的间隔时间。应建立各产品规定贮存条件下的时限控制标准。6、除菌过滤注意事项：双手佩戴灭菌手套，进行消毒后，才允许在层流下操作；始终应在设备/器具受气流保护的开口面下方操作；可能条件下，使用镊子或其他器具（最好使用小工具和仪器，避免破坏层流）；按照以下步骤安装过滤器；灭菌后，在A级区、层流下将过滤器与容器口相连；先将传输（处理）过程中物件的接触点消毒，然后再放入在层流中；准备安装密封（打开密封的包装）；从容器连接处拿起灭菌纸；过滤器底座放好密封圈（打开无菌包装，取出密封圈）；过滤器放置于密封圈上方-用安全夹关闭（