04章核苷酸和核酸2

第五节RNA的种类和结构一、RNA的结构RNA分子中核苷酸之间的连接方式：3´，5´-磷酸二酯键RNA分子构象的多样性二、信使RNA信使RNA（messengerRNA，mRNA）:蛋白质合成的模板，携带一个或几个基因信息到核糖体上指导蛋白质的合成。DNAmRNA蛋白转录翻译原核细胞细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接转运mRNAhnRNA翻译蛋白真核细胞大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C´2亦甲基化，形成帽子结构。大多数真核mRNA的3´末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。编码区和非编码区mRNA结构特点甲基化(m7G5’ppp5’NmpNp--)碱基三、转移RNA转移RNA（transferRNA,tRNA）:按照mRNA的信息，准确地将相应的氨基酸转运至核糖体，参加蛋白质的合成。tRNA一般含有73-94核苷酸，单链20左右位置上为保守核苷酸含10~20%稀有碱基/修饰碱基3´末端为—CCA-OH；5´末端大多数为G，少数为CtRNA二级结构为典型的发卡结构，互补链相接近形成双螺旋区，在氢键的作用下，分子呈三叶草形。链内碱基配对：A-U、G-C、G-UtRNA的二级结构——三叶草形tRNA的三级结构——倒L形四、核糖体RNA糖体RNA（ribosomeRNA，rRNA）:核糖体的结构成分。核糖体作为RNA和蛋白质的复合物负责细胞内蛋白质的合成，是蛋白质合成的场所。rRNA的种类（根据沉降系数）沉降系数（sedimentationcoefficient，s）以每单位重力的沉降时间表示原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNAE.Coli16SrRNA古细菌核糖体的组成MicroRNA（miRNA）MicroprocessorComplex第六节核酸的变性，复性和杂交一、核酸的紫外吸收由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外光有强烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定及纯度分析。A260的应用DNA或RNA的定量A260=1.0相当于:50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸判断核酸样品的纯度DNA纯品:A260/A280=1.8RNA纯品:A260/A280=2.0（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）二、DNA的变性与复性1．变性（denaturation）：在某些因素（如温度、pH等）的影响下，DNA双螺旋区的氢键断裂和碱基堆积力的破坏，使双链变成单链，但不发生共价键的断裂。变性DNA黏度降低，紫外吸收增加（增色效应，hyperchromiceffect）。2.复性（renature）:当变性因素消除后，变性DNA的两条链通过碱基配对重新形成双螺旋的过程,紫外吸收降低（减色效应，hypochromiceffect）。3.DNA的淬火（quench）：双螺旋DNA溶液加热变性之后，使溶液的温度急速降至零度，DNA不能复性而保持单链状态，这种冷处理过程叫做“淬火”。4．退火（anneal）：变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，此过程称为“退火”DNA的紫外吸收光谱变性引起紫外吸收值的改变增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。DNA变性的本质是双链间氢键的断裂结构：螺旋→线团理化性质：紫外吸收↑粘度↓生物活性：生物活性↓或丧失理化性质:紫外吸收↓粘度↑高于Tm值5℃退火缓慢冷却（annealing）迅速冷却生物活性得到部分恢复复性过程淬火5．DNA复性动力学DNA复性过程基本上符合二级反应动力学，其中第一步为慢反应，因为两条链必须依靠随机碰撞找到一段碱基配对的部分，首先形成双螺旋。第二步为快反应，尚未配对的其他部分碱基配对相结合，象拉锁链一样迅速形成双螺旋。DSSk复性反应：S：singlestrandDNAD：doublestrandDNA完全变性DNA的复性反应可表示为：2kcdtdc经重排，积分得：cc01+kc0t=1c0：t=0时，起始DNA的浓度（mol/L）c：t时间时，单链DNA的浓度（mol/L）k：复性反应常数（L/mol·sec）t：复性时间（sec）DNA复性反应的初始浓度co与反应完成一半所需时间的乘积为常数。在一定条件下，复性反应的速度可以用cot1/2来衡量。实验证明K值与复性DNA分子量成正比。cot1/2或K称DNA分子复杂度(complexity)，DNA片段越大复性越慢。DNA的浓度越大复性越快。k三、DNA的熔解温度（meltingtempratureTm）DNA在加热变性时，紫外吸收增加值达总增加值一半时（双螺旋结构失去一半时？）的温度称为该DNA的变性温度，也称熔点或熔解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在82—95度之间，每种DNA都有一个特征性的Tm值。解链曲线如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。影响Tm值的因素DNA的均一性：均质DNATm值范围较窄，异质DNATm值的范围较宽DNA中G-C对的含量经验式:(G+C)%=(Tm-69.3)×2.44盐离子强度：离子强度低的介质中，Tm值较低范围较宽；离子强度较高的介质中，Tm值较高，范围较窄。（DNA在含盐缓冲液中保存）G-C含量对Tm值的影响肺炎球菌盐浓度对Tm值的影响四、核酸的杂交及应用在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交(hybridization)。DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置——生物进化研究测定两种核酸分子间的序列相似性——法医和刑侦鉴定等检测某些专一序列在待检样品中存在与否——疾病预测是基因芯片技术的基础——癌基因的检查核酸分子杂交技术•原理：核酸变性和复性•杂交在持膜上进行——核酸印迹杂交•分类：DNA印迹杂交（Southernblot）RNA印迹杂交（Northernblot）核酸杂交的基本过程制备样品待检测组织样品：动、植物器官、组织，培养细胞，细菌，病毒等核酸：分离提取DNA（RNA）酶切：限制性内切酶消化DNA电泳：凝胶电泳分离酶切DNA混合物DNA变性：获得单链DNA转膜：将核酸样品转移到支持膜上(硝酸纤维素膜、尼龙膜)限制性内切酶消化DNA电泳操作琼脂糖凝胶的制备：熔化，冷却，EB凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/6体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察：紫外灯下观察，照相溶胶凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml琼脂糖凝胶中DNA的观察溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下红色荧光铺胶凝胶凝固后取出梳子点样电泳注意观察溴酚蓝染液的迁移显色变性、转膜制备探针探针（probe）:互补于靶基因顺序的单链DNA或RNA片段，通常带有标记物如：放射性同位素、荧光化合物或半抗原地高辛等，以检测目的基因。杂交杂交炉杂交原理漂洗、检测检测结果