实验室常用试剂配制

实验室常用试剂、缓冲液的配制方法蛋白质电泳相关试剂、缓冲液的配制方法核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法SDS-PAGE分离胶配方表PAGE凝胶配方表（核酸电泳用）各种缓冲液的性质对照表离心机转子的转速与相对离心力RCF(g)间的换算关系相对离心力RCF值（g值）取决于转子的转速（rpm）和旋转半径（r，以mm计算)，可用如下公式表示：此外，根据RCF值（g值)、rpm值、r值之间的关系，可从图A、图B中大致读出各种数值。图A高速转子的相对离心力列线图要确定某一列上的未知值时，用尺子排列其他两列的已知值，所需值落在尺子与第三列的交切处。如：转子速度为80,000rpm，旋转半径为20mm时，相对离心力RCF值约为150,000g。图B低速转子的相对离心力列线图要确定某一列上的未知值时，用尺子排列其他两列的已知值，所需值落在尺子与第三列的交切处。如：转子速度为5,000rpm，旋转半径为40mm时，相对离心力RCF值约为1,100g。密码子表色素在聚丙烯酰胺凝胶中的移动速度*大肠杆菌的基因型野生的大肠杆菌（E.coli）的基因组DNA中有470万个碱基对（bp)，内含4288个基因。E.coli基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有它的可塑造性。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型（Genotype)。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。这些不同基因型特性的菌株在基因工程的研究和生产中具有广泛的应用价值。大肠杆菌基因型的表示方法有如下几种：1．根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成三个斜体字母来表示。例如：DNAAdenineMethylase→dam。2．变异基因不同，导致的结果相同时，用其作用结果的英文名称的前三个字母斜体后加上一个大写字母来表示区别。例如：Recombination→recA、recB、recC。3．某个基因或某个领域缺失时，在其基因型前面加上“”表示。例如：lac-proAB基因缺失时它的基因型表示为(lac-proAB)。4．野生的大肠杆菌具有F因子（质粒）和噬菌体插入片段，当这些质粒或噬菌体片段变异或缺失时，用“()”或“/”等以区别。例如：/F'[traD36、proAB、lacIq、lacZM15]。5．由于某种基因的变异导致大肠杆菌可以明显观察到特征变化，有时也用其表现型代替基因型进行表示。例如：某些抗药性的获得或丧失，用如下方式表示：Streptomycin抗性→Str+或Strr，Ampicillin敏感性→Amp-。(第一个字母要大写,“+”或“r”表示有抗性,“-”表示无抗性或敏感)。6．根据某些特异性蛋白的变异及其导致的结果变化进行表示。例如：TH2菌株上有一种基因型表示如下：hsdS20(rB-、mB-)，其中S20代表特异性识别蛋白发生变异，()中的rB-、mB-表示由于S20的变异而导致B株来源的hsdR和hsdM的功能缺失。使用时注意：基因工程中，经常使用的大肠杆菌几乎都来自于K-12菌株，最近也经常使用由B株及C株来源的大肠杆菌。大肠杆菌B株原来就为lon-，另外MV1184株不具有琥珀抑制基因(Ambersupperssorfree)，由于这些都是原始菌株所不具备的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。主要的基因型说明基因重组相关的基因型recA(Recombination)Mapposition:58min功能：recA基因表达ATP依赖型DNA重组酶，它在λ-噬菌体与基因组DNA的溶原重组时起作用，同时具有对DNA放射性损伤的修复功能。由recA基因的变异所产生的基因型使同源或异源DNA的重组不能进行，保持插入DNA的稳定性，对DNA的转化有利。recB(Recombination)Mapposition:61min功能：recB基因表达ATP依赖型DNase和核酸外切酶V的一个亚基，对recA的DNA重组酶起辅助和促进作用。DNase催化双链DNA的解旋和解链，核酸外切酶V催化单链DNA的裂解，在DNA的重组和损伤修复中发挥重要作用。recB基因的变异导致其DNA重组和修复功能丧失，保证了外源DNA的稳定，有利于DNA转化。recC(Recombination)Mapposition:61min功能：recC基因表达四种酶，即核酸外切酶V，ATP依赖型的核酸内切酶，解旋酶及ATP酶，它们和recA,recB所表达的酶相互协调作用，在DNA的重组及放射性损伤的修复中发挥作用。recC基因的变异导致DNA重组功能缺失，保证外源DNA的稳定性。甲基化相关的基因型dam(DNAadeninemethylase)Mapposition:74min功能：dam基因表达DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特异序列GATC中A的甲基化，保证DNA免受限制性核酸内切酶MboI的切断，同时在DNA复制时也起一定的辅助作用。dam基因的变异导致腺嘌呤（A）甲基化酶活性的缺失，使腺嘌呤(A)不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。dcm(DNAcytosinemethylase)Mapposition:43min功能：dcm基因表达胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCWGG序列，并使第二个C甲基化，即CmCWGG，避免DNA受到相关限制酶的切断。dcm基因的变异导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。mcrA(Modifiedcytosinerestrictionproteina)Mapposition:26min功能：mcrA基因表达大肠杆菌防御体系中起重要作用的mcrA酶，这种酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG特异序列，使之分解，对大肠杆菌本身起保护作用。mcrA基因的变异，导致上述功能缺失，对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。mcrB,C(Methylcytosine-specificrestriction)Mapposition:98min功能：mcrB,C基因表达两种特异性蛋白，即mcrB蛋白和mcrC蛋白，它们在大肠杆菌的防御系统中起重要作用。一般情况下，只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性，mcrC具有识别和调节功能，它能特异性的结合到外源DNA上被甲基化的胞嘧啶（C）的特异序列G5mC上，然后由mcrB蛋白切断（mcrB蛋白是特异性切断外来DNA中G5mC序列的限制性核酸内切酶)，防御外来DNA的侵入。mcrB,C基因的变异，使上述的对外来DNA的防御作用缺失，对质粒的转化有利。mrr(Methylationrequiringrestriction)Mapposition:98min功能：mrr基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一，它能严格限制被甲基化的外源DNA的介入。另外，它对限制酶AccI，CviRI，HinfI(HhaII)，NlaII，PstI以及N6-腺嘌呤甲基化酶和C5-胞嘧啶甲基化酶活性有明显的抑制作用。mrr欠损株（基因型）可用于含有N6-mA和C5-mC的DNA的转化。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。hsdM(Hostspecificitivedefective)Mapposition:99min功能：hsdM基因所表达的DNA甲基化酶是I型限制酶复合体（具有对DNA切断和修补的双重功能）的一部分，它能使DNA双链上的AA(双腺嘌呤)甲基化，保护宿主DNA不被分解。hsdM的变异使细胞内的DNA不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。点突变相关的基因型mutS(Mutator)Mapposition:59min功能：mutS基因表达的蛋白具有识别DNA上错配序列的功能，并能修复其错配序列（GC→AT)，防止基因突变。mutS基因的变异导致DNA的错配序列不能得到修复，容易发生基因突变，这对于利用点突变进行基因改造是有利的。mutT（Mutator）Mapposition:3min功能：野生大肠杆菌在进行DNA复制时，细胞中的8-OXO-dGTP插入模板DNA中的DA位点的效率几乎与插入DC位点的效率相同，导致A-T转换成G-C，使DNA产生变异。而mutT蛋白就是特异性地降解8-OXO-dGTP成为单磷酸盐（8-OXO-dGMP)，这种单磷酸盐状态的G(鸟嘌呤)不能作为底物进行DNA合成，从而防止了上述的基因突变。mutT基因的变异使细胞中8-OXO-dGTP浓度增高，A→C的突变几率增大，有利于利用点突变进行基因改造。dut(dUTPase)Mapposition:82min功能：dut基因表达脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase)，它能水解dUTP成为dUMP，使细胞体内dUTP的浓度维持在较低的水平，尿嘧啶（U）就不易掺入到DNA中，避免了基因发生A→U的突变。dut基因发生突变使dUTPase活性缺失，导致dUTP浓度升高，碱基U（尿嘧啶）极易掺入到DNA中，使其发生A→U的基因突变，有利于利用点突变进行基因改造。ung(UracilDNAglycosylase)Mapposition:56min功能：ung基因表达尿嘧啶-N-糖苷酶，这种酶能特异性识别DNA单链或双链上发生突变的尿嘧啶残基，并从DNA上水解去除尿嘧啶残基，防止DNA发生突变。ung基因的变异导致上述功能缺失，有利于点突变。uvrB(Ultraviolet)Mapposition:18min功能：uvrB基因表达核酸外切酶中的b亚基，这种核酸外切酶具有DNA的切补功能，对紫外线损伤的DNA有修补作用。uvrB基因的变异使细胞中核酸外切酶切除变异碱基的活性缺失，有利于点突变。核酸内切酶相关的基因型hsdR(Hostspecificitydefective)Mapposition:99min功能：hsdR基因表达I型限制酶EcoK(K12株)或EcoB(B株)，在大肠杆菌细胞中起到一种“抗体”的作用，对外来的各种DNA有严格的限制。HsdR基因的变异导致菌株细胞内的I型限制酶EcoK或EcoB活性缺失，这对于外来基因的导入及质粒转化是有利的。hsdS(Hostspecificitivedefective)Mapposition:99min功能：hsdS所表达的特异性蛋白是I型限制酶EcoK或EcoB复合体中的一部分，它专门负责hsdR酶和hsdM酶对DNA序列的特异识别。hsdS基因的变异使hsdR和hsdM不能正确识别其作用的特异DNA序列，可以保持插入DNA的稳定性。endA(Endonuclease)Mapposition:64min功能：endA基因表达非特异性核酸内切酶I，它能使所有DNA双链解开，在DNA的复制和重组中起重要作用。endA基因的变异将使插入的外源DNA更加稳定，提取的质粒纯度更高。停止密码子相关的基因型supE(Suppressor)Mapposition:16min功能：supE基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合，使蛋白质合成停止。supE基因发生变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密码子UAG，蛋白质合成仍能继续，并使UAG作为一个密码子来编码谷氨酰胺（Glutamine)，从而使发生了琥珀突变（AAG→UAG）的基因对蛋白质表达得以延续，因此称supE为琥珀突变抑制因子。supF(Suppressor)Mapposition:27min功能：supF基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合，使蛋白质合成停止。supF基因变异时，不能表达正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密码子UAG，蛋白质合成仍能继续，并使U