miRNA表达谱测序

miRNA表达谱测序miRNA表达谱测序背景介绍SmallRNA是一类长度在20～30nt的RNA分子，主要包括miRNA、siRNA和piRNA。SmallRNA能够调控基因的表达，在细胞的生长、发育、代谢等基础生物学过程中扮演着重要的角色，甚至在癌症等相关疾病形成过程中起着关键的作用。采用HiSeq2000进行SmallRNA测序，一次性获得10M49nt的原始reads，能够快速鉴定特定条件下表达的已知SmallRNA并发现新的SmallRNA，同时还可以研究不同条件下SmallRNA的表达差异。技术路线总RNA提取连接3'RNA接头连接5'RNA接头RT-PCR纯化SmallRNA文库IlluminaHiseq2000平台测序生物信息学分析从mirbase提取哺乳动物miRNA成熟体及前体序列与Myotislucifugus基因组比对预测新miRNA与Pteropus_vampyrus基因组比对预测新miRNAmiRNA及其余sRNA与哺乳动物已知miRNA比对预测出的miRNA与哺乳动物miRNA前体对比剩余sRNA与哺乳动物miRNA前体对比与基因组比对miRNA预测及表达分析数据处理及长度分布数据处理内容与Rfam数据库对比已知miRNA表达分析重复序列合并测序原始数据数据去杂miRNA表达量统计送样要求样品要求1.所需TotalRNA的量均不少于20μg/文库，TotalRNA可以保存在DEPC处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。2.如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g；3.如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g；4.如提供实验材料为培养细胞，请提供1×107培养好的细胞；5.如提供实验材料为血液样品，请提供≥2ml的样品。我们强烈建议在送样的同时客户做好备份，以备后续实验之用。样品纯度要求1.OD260/OD280在1.8-2.0之间，RNA无降解、28S和18S核糖体RNA条带非常亮且清晰（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），28S的密度大约是18S的2倍；Agilent2100检测仪分析RNA完整性数据RIN≥8。2.无蛋白质、基因组DNA污染，如有污染请去蛋白并进行DNaseI处理。请提供至少一种样品的凝胶电泳或者Agilent2100检测仪检测图片，并注明其浓度、体积、OD260/OD280、溶剂名称、制备时间、物种来源以及特别备注。最终以我方定量、质检为准。样品采集为了保证提取RNA的完整性，确保后续实验的顺利进行，请务必确保样品的新鲜，对于如何确保样品的新鲜针对不同的样品获取材料的方法如下：1.动物组织：从活体上迅速的取下组织（切成黄豆粒大小的块状），每切成一个黄豆粒大小的块状立即放入液氮中，重复上述操作，直至足够提取总RNA的量；准备一个50ml的离心管，做相应的标记（样品名称、编号、客户姓名、时间），最好既在管盖上做好标记，也在管壁上做好相应的标记，先放入液氮中预冷2-3min，拿出离心管（离心管的下部分还是保持在液氮中），打开离心管的盖子，将液氮中黄豆粒大小的块状收集进离心管中。2.植物组织：（1）如所采集的是果实、麦穗等体积偏大的样品，收集样品请参照1.动物组织取样方法；（2）如采集的是叶片等体积偏小的样品，请尽量采集嫩叶、幼芽等，每采集一片叶片立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量，后续操作请参照动物组织的采集。（3）如是植物的花，在采集花骨朵的时候请尽量不要采集到花萼、叶片等，每采集一个花骨朵请立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量；后续操作请参照动物组织的采集。3.如提供实验材料为菌丝体，请取500μl的菌液于1.5ml离心管中，离心去上清，剩余菌丝体放入液氮或干冰中，请提供不少于5管的菌丝体。样品运输从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。请填写完整订单，放入自封袋中与样品一起邮寄。为防止RNA的降解，请确保干冰的量足够运送到目的地。我们强烈建议在寄送RNA样品时将RNA保存在75%的乙醇或异丙醇中。如是特殊样品，关于送样量和保存问题请与我们联系沟通，以便双方共同协商解决。提供结果根据客户需求，提供不同深度的序列分析结果