第六章核酸

第六章核酸研究生生物化学核酸＊核酸的生物学意义核酸是一切生物机体不可缺少的组分。核酸是生命遗传信息的携带者和传递者。它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。核酸是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。研究生生物化学核酸＊“核酸与遗传”的发现1868年，F.Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质，即现在被称为核酸的物质。1939年，E.Knapp等第一次用实验方法证实核酸是生命遗传的基础物质。1953年，Crick&Watson双螺旋模型的提出，奠定分子遗传学和分子生物学的基础，具有十分重大的意义。2004年，Crick逝世。研究生生物化学核酸Content核酸的分类和组成核酸的结构核酸的性质核酸的合成核酸一级结构测定：测序研究生生物化学核酸1、核酸的分类和组成核酸分类：脱氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid核酸功能：DNA，含有所有生物的遗传信息；RNA，负责翻译和逆转录。研究生生物化学核酸核酸（DNA和RNA）是一种线性多聚核苷酸，它的基本结构单元是核苷酸。核苷酸本身由核苷和磷酸组成,而核苷则由戊糖和碱基形成DNA与RNA结构相似，但在组成成份上略有不同。（1）核酸的组成研究生生物化学核酸二者的区别？研究生生物化学核酸附1：saccharideOHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖研究生生物化学核酸附2：base腺嘌呤AdenineNNNHNNH2NHNNHNONH2鸟嘌呤guanineNHNHOO尿嘧啶uracilNNHNH2O胞嘧啶cytosineNHNHOO胸腺嘧啶thymine研究生生物化学核酸（2）nucleoside胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键研究生生物化学核酸（3）nucleotide•B=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶•核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。OBOHOHOH2CPOHHOO核糖核苷酸OH2CPOHHOOOBOH脱氧核糖核苷酸研究生生物化学核酸（4）Polynucleotide多聚核苷酸是通过核苷酸的C5’-磷酸基与另一分子核苷酸的C3’-OH形成磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。方向：5’-3’为正方向。表示方法：研究生生物化学核酸PP5'3'3'5'PP5'3'P5'3'ACGT5′PAPCPGPCPTPGPTPA3′或5′ACGCTGTA3′*MessengerRNA约占总RNA的5%。不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大,寿命短暂它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地－－核糖核蛋白体。真、原核生物的不同：真核生物为多顺反子研究生生物化学核酸*TransferRNA约占总RNA的10-15%。它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用。已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。RNA分子的大小很相似，链长一般在73-78个核苷酸之间。研究生生物化学核酸约占全部RNA的80%。是核糖核蛋白体的主要组成部分。rRNA的功能与蛋白质生物合成相关。*RibosomeRNA研究生生物化学核酸（5）核苷酸的衍生物-ATPO-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(ATP)ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物。是一种重要的能量中间体研究生生物化学核酸（6）核苷酸的衍生物-GTPGTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体，是生物体内游离存在一种高能化合物。在许多情况下,ATP和GTP可以相互转换。O-POO-NOHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-NNNHNNH2研究生生物化学核酸（7）核苷酸的衍生物－cAMP&cGMP•cAMP(3’,5’-环腺嘌呤核苷单磷酸)和cGMP(3’,5’-环鸟嘌呤核苷单磷酸)的主要功能：作为细胞之间传递信息的信使。•cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4条件下,cAMP和cGMP的水解能约为43.9kJ/mol，比ATP水解能高得多研究生生物化学核酸2、核酸的结构按结构层次：一，二，三。核酸的碱基顺序是核酸的一级结构。DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。而mRNA的碱基顺序，则直接为蛋白质的氨基酸编码，并决定蛋白质的氨基酸顺序。研究生生物化学核酸（1）tRNA的一级结构分子量25000左右，大约由70－90个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3‘-末端都具有CpCpAOH的结构。5个区及功能?研究生生物化学核酸（2）mRNA的一级结构真核细胞mRNA3‘-末端有一段长达200polyA（转录后加入)，称为tail，5’-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“Cap”。原核生物的mRNA一般无polyA，但某些病毒mBNA也有polyA5’-Cap与蛋白质合成的起始作用有关；polyA与mRNA从细胞核到细胞质的转移有关，与mRNA的半寿期有关，新合成的mRNA,．polyA链较长，而衰老的mRNA，polyA链缩短研究生生物化学核酸（3）rRNA的一级结构局部螺旋，许多rRNA的功能迄今仍不十分清楚研究生生物化学核酸附1：tRNA的二级结构研究生生物化学核酸在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型。附2：tRNA的三级结构研究生生物化学核酸1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。二级的三种主要形式：A，B，Z三种模型（4）DNA的结构研究生生物化学核酸研究生生物化学核酸DNA分子由两条DNA单链沿同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5′→3′，而另一条链的方向为3′→5′。螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为3.4nm。嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧，碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90°。A、B－DNA双螺旋结构特点研究生生物化学核酸C三GA＝T研究生生物化学核酸DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键；由于双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响；介质中的阳离子（如：Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力、范德华引力等。改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。B、DNA双螺旋结构的稳定性研究生生物化学核酸（3）DNA在染色体（质）中示意图研究生生物化学核酸3、核酸的性质核酸的互变异构酸碱性质核酸的理化性质核酸的变性和复性研究生生物化学核酸（1）核酸的互变异构碱基的芳香环与环外基团可以发生酮式—烯醇式或胺式—亚胺式互变异构－－DNA变异的自然动力！研究生生物化学核酸（2）核酸的酸碱性质嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱性：环内氨基的pKa值约为9.5，基环外的氨基（存在于A、G和C）的碱性很弱，在生理pH条件下不能被质子化，因此嘌呤和嘧啶碱基碱性主要是环内氨基的贡献。碱基都具有芳香环的结构特征，嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构。研究生生物化学核酸（3）核酸的理化性质A、物理性质溶解性：易溶于碱或水，不溶于有机溶剂？离心沉降的性质：超离心法。氯化铯梯度离心场中，上－下：PN-lineDNA-circleDNA/plasmidDNA电泳：泳动方向？研究生生物化学核酸B、碱基环氮原子的烷基化反应在一定条件下，碱基环上氮原子可以发生烷基化反应在同样条件下，U和T基本上不起反应。应用CH2N2作为烷基化剂，则所有碱基都能发生上述反应。HNN+H2NOCH3NNRNNRN+NNH2CH3NN+NH2CH3NNRNNNH2N+NRCH3N+NRCH3HNNH2NON+NNH2ORCH3研究生生物化学核酸为什么能够两性电离：与蛋白质相似，核酸分子中的酸性基团（磷酸基）碱性基团（氨基），使核酸具有两性性质。等电点：由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如：DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5RNA的等电点比DNA低的原因：是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，而DNA没有这种作用。C、核酸两性电离及等电点研究生生物化学核酸D、核酸的水解酸或碱水解：核酸分子中的磷酸二酯键可在酸、碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别，如：在0.1mol/LNaOH中，RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷，DNA则不受影响。原因：这种水解性能上的差别，与RNA2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。研究生生物化学核酸生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。根据作用方式分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。•酶水解研究生生物化学核酸E、核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，一般在260nm左右有最大吸收峰具有增色效应和减色效应可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据，如：A260/A280DNA1.8,RNA=2.0研究生生物化学核酸*UVadsorption研究生生物化学核酸F、核酸的变性、复性与杂交①denaturation核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。引起核酸变性的因素:温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。研究生生物化学核酸denature研究生生物化学核酸附：DNA变性的特性-1突变性：变性过程在很窄温度区间内Tm完成。Tm值预测：一般DNATm在70-85C之间，与分子中G+C含量有关，可反映DNA分子中GC含量。经验计算公式：（G+C)%=(Tm-69.3)×2.44结构变化：当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开形成无规线团。性质变化：DNA变性后一系列性质随之发生变化，如紫外吸收(260nm)值升高,粘度降低等。研究生生物化学核酸附：DNA变性的特性－2检测：利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。如天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%，RNA变性后约增加1.1%。这种现象称为增色效应.影响因素：离子类型、强度、浓度？RNA变性行为所引起的性质变化没有D