P53基因在血细胞中的表达

P53基因在血细胞中的表达RT-PCR的应用技术介绍：RT-PCR•RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆转录PCR•RT-PCR首先经反转录酶的作用以RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。•RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。实验原理•在血细胞里面提取RNA，以其mRNA为模板，然后逆转录为cDNA，再通过pcr技术进行扩增，进行20-30次，达一定量后进行电泳分析，根据其浓度即可判断该基因在血细胞中是否表达以及表达的程度。p53基因序列的获取•在Genbank上搜索AF136270.1得到p53基因的序列，显示有8个外显子，为了提高特异性，选择包含2个外显子的序列，选择外显子3和7，复制其对应的序列拼接在一起，在genbank的设计引物工具里面获取引物序列。详细步骤如下：获取基因序列NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation）是指美国国立生物技术信息中心。NCBI的任务是发展新的信息学技术来帮助对那些控制健康和疾病的基本分子和遗传过程的理解。序列有8个外显子选择的是3和7两个外显子，上面数字指这个外显子，该选择只是为了使其特异性更高，便于提高实验准确度。该基因全部碱基序列这是p53基因的全部碱基序列，找到3号和7号所对应的序列，复制其序列，然后打开genbank所提供的引物设计工具引物设计步骤将3号和7号外显子序列复制到右图框中，条件已经设定好，其Tm值为57-63℃之间得到的引物序列上一步中得到的引物序列提供了10个待选择，可以看出给了碱基序列、长度Tm值、GC%等数据供参考设计工具所给的前4个引物序列对比引物设计原则•1、长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。•2、G十c含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。•3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。•4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。•5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。•6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。•7、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。最佳引物根据上述引物设计原则，选择第一个引物序列，其Tm值符合条件，GC%在合理范围内血细胞RNA提取•1、冰冷的PBS液5-10ml洗涤细胞两次，加入Trizol1ml，混匀，室温静置15min•２、小滴管吹打，使细胞完全裂解，然后完全转移至1.5mlEP管内•3、加入0.2ml的氯仿，剧烈震荡混匀30s。室温静置10min，上层水相，下层为酚相•4、4度离心，15000rpm，15min•5、将上层水相移至另一EP管内，400-500ul，切勿吸到蛋白，加入等量的异丙醇，充分混匀，室温静置10min。然后4度，15000rpm，离心10min•6、弃掉上清，加入冰冷的75%乙醇漂洗两次，用移液器将液体吸干，室温干燥10-20分钟，待产物呈半透明状，加入20ulDEPC处理过的水溶解RNAPBSTrizol成分磷酸缓冲盐溶液RNA抽提试剂RT-PCR反应结论RT反应第一步RT反应第二部PCR反应一PCR反应二电泳分析结果反应条件及试剂RT第一步•RNA抽提物5μl•引物2μl•RNAsin0.5μl•65℃15分钟•立即放入冰浴RT第二步•RNAsin0.5μl•10mMdNTP1μl•5×RT缓冲液4μl•25mMMgCl24μl•AMV逆转录酶3μl•37℃1.5小时•94℃5-10分钟•进行PCR反应条件及试剂PCR第一步PCR第二步25mMMgCl23μl10×PCR缓冲液5μl10mMdNTP1μl上下游引物10pmol/μl2.5μl×2CDNA模板5μlddH2O30μlTaq酶1μl轻质石蜡油50μl100μl25mMMgCl22μl10×PCR缓冲液5μl10mMdNTP1μl上下游引物10pmol/μl2.5μl×2CDNA模板2.5μlddH2O34μlTaq酶0.5μl轻质石蜡油50μl100μl94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环94℃45秒，55℃40秒，72℃1分钟为第二步30个循环94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环94℃45秒，50℃40秒，72℃1分钟为第二步40个循环电泳1.配0.5×TBE电泳缓冲液300ml2.胶浓度1.7%（40ml0.5×TBE加0.68g胶）3.微波炉中火2分钟溶解胶4.冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）5.放入梳子，浇板，待凝固6.加8μlPCR反应产物+2μl溴酚兰7.电泳50-80V（每㎝5V）结果分析用相应的5-8ulDNAMarker,2%琼脂糖凝胶电泳，电压110-120V，30-45分钟。于紫外透视仪下观察有无特异性扩增带，并照相记录。β-actin扩增产物大小540bp，340bp。GAPDH扩增产物大小142bp。注意事项•双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。•复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低3—5℃的条件下进行。•PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。谢谢