895.多光子激发荧光显微成像

多光子激发荧光显微成像⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯多光子激发激光扫描显微镜传统光学显微镜激光共聚焦显微镜⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯早期显微镜1、光源2、载物台3、光学放大系统⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯普通显微镜与激光扫描显微镜不同光源经过样品。（a）普通显微镜的全场照明（b）具有高数值孔径油镜的激光扫描显微镜，将光聚焦在一点。荧光显微镜ExcitationFilterObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularsample⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯ObjectiveEmissionPinholePMTEmissionFilter共聚焦显微镜⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯基本原理⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯多光子激发---一个非线性过程¾两个或多个光子同时激发¾荧光强度正比于(激光强度)n¾荧光限制在焦点⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯多光子与单光子比较单光子双光子*照明锥体大体积激发*激发局限在焦点*荧光强度正比于I*荧光强度正比于In*光漂白和光损伤较大*不需要针孔收集散射光*光漂白和光损伤小*深度成像⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯多光子在生物成像中的优势在生物显微镜观察方面,最先考虑的必然是不损坏生物本身的活性状态,维持水分、离子浓度、氧和养分的流通,而且在光观察场合,无论是热还是光子能量方面都必须停留在细胞不受损伤的照射量、光能量内。多光子显微镜不仅容易制成,而且还具有很多优点。如三维分辨率、深度侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面,均有以往激光显微镜不具备,或具有无法比拟的超越特性。⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯连续和脉冲激光器短脉冲的优点*高的瞬时功率*连续光脉冲光)/()(11−−=nnnavgffPIτ⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯为什么使用飞秒激光器？¾深度成像需要更高的输出功率¾皮秒脉冲不能实现三光子激发¾毒性和漂白小100fs—1000fs的脉冲激光产生同样荧光信号所需要的相对平均激发功率脉冲宽度增加时多光子激发产生荧光强度的相对值不同宽度的脉冲对样品不同深度成像时所需要的相对功率⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯多光子荧光成像™™深度成像：与共聚焦相比，能更好的对厚散射物质成深度成像：与共聚焦相比，能更好的对厚散射物质成像。像。™™观察活细胞：离子测量观察活细胞：离子测量((i.e.Cai.e.Ca2+2+))，，GFPGFP，，发育生物学发育生物学等等——减少了光毒性和光漂白，能对细胞长时间观察。减少了光毒性和光漂白，能对细胞长时间观察。™™产生同样波长产生同样波长((振荡数振荡数))荧光时荧光时,,因多光子吸收采用的波因多光子吸收采用的波长是单光子吸收的长是单光子吸收的22倍以上倍以上,,所以显微试样中的瑞利散射所以显微试样中的瑞利散射小小11位数以上位数以上,,从而使荧光测定的信噪比提高了。从而使荧光测定的信噪比提高了。™™自体荧光自体荧光NADHNADH、、SerotoninSerotonin、、皮肤等。皮肤等。⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯多光子与共聚焦比较⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯多光子与共聚焦比较⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯多光子与共聚焦比较多光子显微镜对成像深度的改善¾¾利用红光或红外光激发，光散射小。利用红光或红外光激发，光散射小。¾¾激发光子只在焦点处被吸收。单光子激发光子只在焦点处被吸收。单光子激发所用的紫外或可见光在光束到达焦激发所用的紫外或可见光在光束到达焦平面之前会因荧光体的吸收而衰减。平面之前会因荧光体的吸收而衰减。¾¾不需要针孔，能够收集散射荧光光不需要针孔，能够收集散射荧光光子，深层成像的信噪子，深层成像的信噪比好。比好。多光子激发对紫外成象的帮助¾¾在可见光脉冲中能得到紫外衍射的显微在可见光脉冲中能得到紫外衍射的显微观察像。即使不使用紫外域光源、光学观察像。即使不使用紫外域光源、光学元件仅用可见光源、光学元件就能得到元件仅用可见光源、光学元件就能得到紫外光激励的高空间分辨率图像。紫外光激励的高空间分辨率图像。LaserScanningMicroscopyconfocallaserscanningmicroscopymultiphotonlaserscanningmicroscopylinescanXtX-tscans6msX-YscansXYt400msfocalplanescanningmirrorlasercellwithprobeXYX-Yscannotesb.jenks,2000ConfocalMultiphotonLaserScanningMicroscopyversusspecimengaslaserlensS0S1pinholethefocalpointofilluminationisthesameasthefocalpointofdetectionthus...ConfocalnotesphotomultipliertubeConfocalMultiphotonLaserScanningMicroscopyversusspecimengaslaserlensS0S1specimensolid-statelaser(short)λ(long)λAr/Krtitaniumsapphire10nsS0S11P:1ssunlight2P:10,000,000ysunlight3P:ageofuniversesunlightnotesendofslideshow⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯MultifocalMultiphotonMicroscope⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯目前,由于多光子技术的发展时间短,技术本身也存在一些局限:(1)只能对荧光成像。(2)如果样品包括能够吸收激发光的色团,如黑色素,样品可能受到热损伤。(3)分辨率略有降低,虽然可以通过同时利用共焦的小孔得到改善,但是信号会有损耗。(4)受昂贵的超快激光器限制,目前,多光子扫描显微镜的成本较高。多光子激发扫描系统的缺陷⎯⎯TheKeyLaboratoryofBiomedicalPhotonicsofMinistryofEducation,China⎯⎯谢谢！