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毕业设计（论文）题目：小鹅瘟的诊断研究学生姓名于利凤指导教师郭宇飞二级学院动物医学与技术学院专业动物医学班级07动物医学(单本)班学号0710120702提交日期2011年5月15日答辩日期2011年5月21日金陵科技学院学士学位论文第一章目录2金陵科技学院学士学位论文目录目录中文摘要…………………………………………………………………………ⅠAbstract…………………………………………………………………………Ⅱ1.绪论…………………………………………………………………………12.材料和方法……………………………………………………………………22.1材料………………………………………………………………………22.1.1病料……………………………………………………………………22.1.2实验室诊断所用的材料和试剂……………………………………22.1.3各种仪器设备…………………………………………………………22.2方法…………………………………………………………………………42.2.1临诊诊断方法…………………………………………………………32.2.2实验室诊断方法………………………………………………………33.结果和分析…………………………………………………………………54.小结与讨论……………………………………………………………………75.致谢………………………………………………………………………96.参考文献……………………………………………………………………10金陵科技学院学士学位论文摘要I小鹅瘟的诊断研究摘要小鹅瘟是由小鹅瘟病毒所引起的雏鹅的一种急性或亚急性的败血性传染病。以精神委顿，离群独偶，鼻孔流出浆液性鼻液，患鹅频频摇头，拉灰黄色或黄绿色稀粪，神经紊乱，小肠中后段黏膜坏死脱落与纤维素性渗出物凝固形成栓子，形如腊肠状为特征。常呈败血经过，发病率和死亡率很高，对养鹅业生产危害极大。本课题根据流行病学、临床症状、剖检病理变化、微生物学、分子生物学等多种检测手段建立行之有效的诊断方法，对本病做出有效诊断。从而可以积极做好防治措施，达到减少家禽的发病率，减少经济损失，提高生产效率的目的。关键词：小鹅瘟，诊断，研究金陵科技学院学士学位论文摘要II金陵科技学院学士学位论文AbstractIIThediagnosisofgoslingplagueAbstractGoslingplagueiscausedbygoslingplaguevirusandappearedtobeanacuteorsubacutesepticinfections.Clinicalsignsareasfollows,dispiritedspirit,leavegroupandfindaplacetostayalone,serousnasalsecretions,shookheadanddischargegrayishyelloworyellow-greenexcrement,neurologicaldisorders,mucosanecrosisandfibrinousexudates,atthesecondhalfpartoftheofthesmallintestinesectionsolidifiedplugappearedandshapedlikeasausage.Usuallyshowedsepsisperformance.Andthemorbidity&mortalityisusuallyveryhigh,causinggreatharmtothegooseproductionindustry.Thesubjectofthispaperfocusedonthebasisofepidemiological,clinicalsymptoms,autopsypathology,microbiology,molecularbiologyandotherdetectionmeanstomakeeffectivediagnosisofthisdisease,sothatunderstandingandclinicaltreatmentcouldbeappliedtogoandactivelypreventivemeasurescouldbetakentoreducetheincidenceofthisdisease,thereforeeconomiclossesandproductionefficiencycouldbeimproved.Keywords:Gooseplague,Diagnosis,Research金陵科技学院学士学位论文AbstractIII金陵科技学院学士学位论文第一章绪论11绪论小鹅瘟又称鹅细小病毒感染，是由鹅细小病毒引起雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性的败血性传染病。该病主要侵害4—20日龄雏鹅，以传播快、高发病率为特征，是当前危害养鹅业的主要病毒性传染病。典型病变为肠粘膜脱落坏死，严重的渗出性肠炎，形成香肠样栓子，堵塞肠管；急性下痢，有时有神经症状。病原为细小病毒科细小病毒属的鹅细小病毒，最早由方定一[1]在江苏扬州发现，并分离到病原。该病毒对外环境的抵抗力较强，56℃能耐受3小时，pH3时仍稳定，对一些消毒药有较强抵抗力。病鹅和带毒鹅是本病主要的传染源。传播途径主要是消化道，被病毒污染的饮水、垫草、饲料、工具等也是本病的主要传播途径，此外还可以通过种蛋进行垂直传播。在自然情况下，目前发现的小鹅瘟病毒的易感动物只有鹅和番鸭。鹅的易感性是随着年龄的增长而减弱。主要是出壳后3—20日龄之间的雏鹅群发病而且表现出明显的症状，1周龄以内的雏鹅死亡率可达100%，10日龄以上者死亡率一般不超过60%，20日龄以上的发病率低，而1月龄以上则极少发病。成年鹅也感染但不表现明显症状而成为带毒者。本病的爆发和流行有明显的周期性，大流行后1-2年内一般不容易发病。金陵科技学院学士学位论文第二章材料和方法22材料和方法2.1材料2.1.1病料：小鹅瘟发病后的雏鹅，来源于规模化养殖场。2.1.2实验室诊断所用的材料和试剂：胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)由本实验室自己配制，材料有胰蛋白胨大豆琼脂,超纯水PCR反应试剂：PCR引物，由生物技术公司合成。PCR模板：由本实验室自己配制。TBE电泳缓冲液2.1.3其他的各种仪器设备等：微升微量加样器：型号QYQ1000微升电泳仪：型号DYY-2C电泳槽：型号JY-SPC北京君意电泳设备有限公司立式压力蒸汽灭菌器型号YXQ-LS-SII台式离心机：型号TGL-16G上海安亭科学仪器有限公司取液器：型号QYQ1000微升空气恒温摇床：型号KYC-100常规PCR仪：空气浴振荡器：型号KYC-100显微镜：型号CX418F旋涡混合器：型号MV5-1北京东方开物科学器材有限公司DNAMarker：天根生化科技（北京）有限公司2×TaqPCRMasterMix：天根生化科技（北京）有限公司病毒基因组DNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司琼脂糖：Oxoid公司琼脂粉：Amresco公司电子天平型号BS110S宁波新芝生物科技有限公司金陵科技学院学士学位论文第二章材料和方法3电热恒温培养箱型号JN303-南京市江宁电器仪器厂优普超纯水制造系统型号UPH-II-102.2方法2.2.1临诊诊断方法通过症状观察、流行病学调查、病变检查等临诊诊断的手段对发病鹅群进行相关方面的研究2.2.2实验室诊断方法培养基的制备：胰酶大豆琼脂，超纯水，浓度4%，加热至溶解，121℃灭菌15min后冷却到50℃左右，每只灭菌培养皿倒15ml左右的琼脂，将皿盖盖上，使培养基平铺于皿底，平放在实验桌上，切勿倾斜，勿产生气泡，等其凝固。细菌的培养：利用病鹅肝脏接种到TSA培养基，注意进行无菌操作，左手持皿，用左手的拇指，食指及中指将皿盖揭开呈20°左右的角度，右手持接种环，致密画线于培养基表面或者用“十”字形划法，然后在酒精灯上把接种环上把多余的材料烧毁，注意，小心勿将培养基划破，也不宜重复过多的划线，划好后盖上皿盖，倒置于恒温箱，37℃培养48小时。病毒中和试验（VN）：将采集的病料研磨并作相关处理后，和已知的小鹅瘟高免血清混合，然后接种于易感的鹅胚，并且作相应的阴性和阳性对照，来进行小鹅瘟病毒的鉴定。PCR检测：TBA电泳缓冲液（5×）：Tris：54g，硼酸：27.5g，0.5mmol/LEDTA（ph8.0）：20ml，调溶液ph为8.3；121℃高压灭菌30min后室温保存，工作浓度为0.5×小鹅瘟病毒基因组DNA的提取：利用组织病毒基因组DNA提取试剂盒，参照说明书进行操作，提取小鹅瘟病毒的DNA模板小鹅瘟病毒聚合酶链式反应PCR引物的设计：根据GenBank上已经提交的小鹅瘟基因序列（GenBank登录号：NC_001701.1），应用引物设计软件PrimerPremier5.0设计一对扩增该基因的引物。相关信息如下：Upperprimer:CAGTCATTCGGAGGTAATCTTLowerPrimer:CGGGTTGTAGGAGATACTGTC金陵科技学院学士学位论文第二章材料和方法4由生物技术公司合成，PAGE纯化。金陵科技学院学士学位论文第三章结果和分析53结果和分析3.1临诊诊断方法结果：小鹅瘟发生于雏鹅，小鹅瘟的发病率很高，，死亡率也相当高。在发病过程中，死亡率是逐渐上升的、连续的。最早发病时，不表现出什么症状就死亡了。检查时，外表没有异常变化，剖开胸腹腔也没有异常情况。经过了一周左右的病程，小鹅表现需水增加，需料减少。鹅呆呆地站着，缩头松毛，无精打采，眼睛不想睁开，打瞌睡，步行艰难，离群独处，不吃食，喜饮水，严重下痢，排灰白或淡黄绿色并混有气泡的稀粪，屁股不干净。鼻孔流出浆液性分泌物，摇头，口角有液体甩出，呼吸用力，甚至朝天哈气，做吞咽动作，喙端色泽变暗，嗉囊是空的，中间有多量气体或液体。有的严重的颈部扭转，两腿麻痹，不能站立。剖检病理变化主要的是小肠后段粘膜发炎，弥漫性出血，有坏死灶，肠腔内有大量渗出物和带条状假膜脱落；小肠中后段膨大增粗，肠壁变薄，内有容易剥离的腊肠样栓子。小肠各段充血和明显肿胀，黏液增多，黏膜上出现少量黄白色蛋花样的纤维素性渗出物。在中下肠段形成淡黄色的假膜或形成直径约0.3cm、长20cm左右细条状的凝固物，在小肠出现富有特征性的凝固性栓子。这些肠段膨大增粗，可比正常增大1-3倍，肠壁菲薄，触摸有紧实感，外观如香肠状，主要发生在小肠中下段的空肠和回肠部，但也可在其它肠段出现。栓子是比较粗大的凝栓物，紧密充满肠腔，由两层构成，中心为干燥密实的肠内容物，外面由纤维素性渗出物和坏死组织混杂凝固形成的厚层假膜包被，或者凝栓物完全是由纤维素性渗出物和坏死物凝固而成，但形状不一，有的呈圆条状，表面光滑，两端尖细，长度可达20cm左右，如蛔虫样，有的呈扁平状，灰白色如绦虫样。这些凝栓物均不与肠壁粘连，易从肠腔中拽出，肠壁仍保持平整，但黏膜面明显、充血、出血，有的肠段出血严重，黏膜面成片染成红色。3.2实验室诊断方法细菌的培养：利用病鸭肝脏接种到TSA培养基，注意无菌操作，划好盖上皿盖，倒置于恒温箱，37℃培养48小时以上。经过培养，未发现有菌落生长。金陵科技学院学士学位论文第三章结果和分析6病毒中和试验（VN）：将采集的病料研磨并作相关处理后，和已知的小鹅瘟高免血清混合，然后接种于易感的鹅胚，来进行小鹅瘟病毒的鉴定。结果发现，实验组的鹅胚得到了良好的免疫保护，而对照组的鹅胚出现了死亡，这说明病料当中的病毒为小鹅瘟病毒，与小鹅瘟高免血清进行了良好的中和作用。3.6小鹅瘟PCR扩增产物的电泳检测结果PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，可见一条大小约为1200bp的DNA条带，扩增片段大小与预期大小相符，而对照组为阴性，未出现任何条带（图2）。图2小鹅瘟病毒DNA的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果金陵科技学院学士学位论文第四章小结和讨论74小结和讨论小鹅瘟仅仅自然感染1月龄以内的雏鹅，雏番鸭也易感染。鹅和番鸭是唯一可