毕业论文

学士学位论文论文题目：一例疑似繁殖障碍型猪瘟的RT-PCR诊断作者姓名黄伟强指导教师戴爱玲老师刘建奎老师学科(专业)动物医学所在学院生命科学学院交稿时间2011年6月龙岩学院毕业论文（设计）开题报告2010年月日论文（设计）题目：一例疑似繁殖障碍型猪瘟的PCR诊断姓名黄伟强年级2007级所在院系生命科学学院专业动物医学指导教师戴爱玲、刘建奎开展本课题的意义及工作内容：猪瘟(classicalswinefever,CSF)是“万病之源”，近年来猪瘟流行形势发生了很大的变化，从频发的大流行转为无规律的散发性流行；病原毒力降低，临床表现为由典型变为非典型。主要表现为母猪繁殖障碍、猪瘟病毒持续感染、胎盘感染、出生仔猪先天性颤抖等，对养猪业的发展与经济效益造成严重的影响。本课题通过问诊、临床症状和病理变化观察对一例疑似繁殖障碍型猪瘟进行调查，同时应用RT-PCR方法对其诊断，对于临床繁殖障碍型猪瘟的防控具有指导意义。总体安排及进度：2010年3月资料搜索以及必要实验用品的准备；2010年4月到7月搜集、阅读论文资料、做实验；2011年1月底提交论文提纲、开题报告；2011年2月到5月完成初稿；2011年5月修改论文；2011年5月末定稿。课题预期达到的效果：1）用RT-PCR技术检测出病料感染猪瘟病毒；2）了解繁殖障碍型猪瘟的危害及猪瘟净化措施；指导教师意见：签名：一例疑似繁殖障碍型猪瘟的RT-PCR诊断生命科学学院动物医学专业2007060418黄伟强指导教师：戴爱玲、刘建奎【摘要】龙岩市新罗区某存栏300头母猪的猪场，部分妊娠母猪发生早产或晚产、产死胎或弱胎等繁殖障碍，弱胎猪多在在2~3日龄时死亡，而同窝貌似正常的哺乳仔猪在7日龄以后逐渐出现拉稀、死亡现象。本文参考已发表的CSFVE2基因序列设计引物，预计扩增的目的基因片段为288bp，对发病仔猪和死胎进行猪瘟病毒的诊断，结果猪瘟病毒阳性，表明该猪场母猪出现繁殖障碍是感染猪瘟病毒。【关键词】繁殖障碍猪瘟RT-PCRAsuspectedcaseofreproductivefailureintheRT-PCR-baseddiagnosisofclassicalswinefeverCollegeofLifeSciencesVeterinaryMedicine2007060418weiqianghuangInstructor：AilingDaiJiankuiLiu【Abstract】ThepigfarmofXinluodistrict,Longyancityherds300sows.Partofthepregnantsowsoccurredpretermbirthorlateproduction,productionstillbirthorWeaktireofreproductivedisorders.Theweaktirepigwilldiewithin2-3days,andseeminglynormallittermatesappeareddiarrhea,deathafter7days.ThetextreferencethepublishedCSFVE2genesequencetodesignprimer,expectedtheamplifiedfragmentoftargetgeneis288bp.DoaCSFVtesttoincidence’spigletandstillbirth,thepositiveresultsofclassicalswinefevervirustoshowthatthefarmsowsoccurreproductivefailureisClassicalswinefevervirusinfection.【Keywords】ReproductivefailureCSFRT-PCR目录前言........................................................................11.发病情况调查.............................................................21.1发病特点.............................................................21.2临床症状............................................................21.3病理变化............................................................22实验室PCR检测............................................................22.1材料.................................................................22.1.1病料..........................................................22.1.2试剂..........................................................32.1.3主要仪器.......................................................32.2方法................................................................32.2.1引物设计.......................................................32.2.2病毒RNA提取...................................................32.2.3CSFVcDNA的合成...............................................32.2.4PCR扩增.......................................................33结果.......................................................................43.1临床诊断结果.........................................................43.2PCR检测结果.........................................................44结论与讨论................................................................4参考文献....................................................................5致谢.....................................................................61前言猪瘟是一种急性、热性、高度接触性病毒性传染病，可感染各种年龄的猪和野猪，一年四季流行，传染性极强，发病率和致死率均很高，危害极大，国际兽医局（OIF）将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，我国也将该病列为一类传染病[1-3]。1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲，中国大部分地区都有发生[4]。我国是猪瘟流行较严重的国家，每年因猪瘟死亡猪占饲养量的3%-5%，占病死猪的30%左右，经济损失巨大。虽然我国自建国以来一直推行以疫苗免疫为主的猪瘟综合防制措施，对猪瘟的防制起到了有效作用，但猪瘟还时有发生，无论是病原，流行形势，还是临床表现和病理变化均发生了明显的改变。出现温和型（非典型）猪瘟，特别是怀孕母猪感染常呈带毒状态，不表现明显的临床症状，但怀孕母猪常出现流产、死胎和木乃伊化繁殖障碍症状。母猪带毒后还表现持续性病毒血症等持续感染状态，持续感染是繁殖母猪发生猪瘟的一种主要方式[5]，被感染的猪留种，就会形成胎盘感染[6]→仔猪流行猪瘟→免疫耐受→免疫失败→持续感染→母猪繁殖障碍→胎盘感染这样一个恶性循环。猪瘟病毒通过妊娠母猪的胎盘传染给胎儿，这些经胎盘感染出生后存活的仔猪先天带毒,不表现临床症状而长期排毒；母猪妊娠早期感染猪瘟病毒，往往造成母猪繁殖障碍，表现流产、产死胎和木乃伊胎[7]；对这些猪进行疫苗注射不能产生免疫应答，出现免疫耐受，造成免疫失败。由于持续性感染，仔猪先天性免疫耐受，对疫苗免疫应答低下，阳性猪群常与蓝耳病、伪狂犬病、猪肺疫、弓形虫病等混合感染，并往往继发链球菌、猪副嗜血杆菌、仔猪副伤寒、大肠杆菌病、气喘病及附红细胞体病等，使病情复杂化，防治效果不明显，增大了发病率和死亡率，给养猪业带来巨大的经济损失。繁殖障碍型猪瘟由CSFV的温和毒株引起[8]。多数病例剖检无典型的肾、膀胱出血及脾出血性梗死。扁桃体有轻度水肿，病程长者，出现坏死、溃疡和化脓。回盲瓣可见有溃疡。胸腺萎缩及外周淋巴样器官中淋巴细胞排空以及滤泡明显是繁殖障碍型猪瘟的最重要病变。患病猪在最初接触病毒后的数月内不表现临床症状，可能与其在胎儿时期接触病毒感染遗留结果有关。患持续性CSF的猪，不产生抗病毒的中和抗体，然而对CSFV以外的抗原抗体反应一般正常，表明对该病毒有特异性免疫耐受性。CSFV抗原广泛分在于上皮组织、淋巴样组织和网状内皮组织中。在这些持续感染的猪里，外周血液淋巴细胞对有丝分裂原的反应只是轻度降低。[9,10]出生后感染CSFV慢毒株，病毒生长好像只局限于扁桃体和局部淋巴结。扁桃体腺窝上有皮轻度变性、少数细胞脱落、网织细胞增生或者出现散在坏死灶，其中夹杂有较多浆细胞；淋巴小结增多、生发中心明显，但外周区域淋巴细胞较少；血管内皮细胞肿胀及增生。淋巴结表现为皮质窦出血，淋巴小结体积变小，淋巴细胞减少，并有不同程度的坏死；毛细血管内皮细胞肿胀或增生，有的会出现透明血管栓，实质可见大量的嗜酸性粒细胞浸润。病毒可以通过血液转移，怀孕母猪通过胎盘传染胎儿是由血液传播。病毒可能在一处或多处通过胎盘屏障，随后在胎儿之间传播。随着胎儿的生长发育，病毒株的致病性对胎儿形成先天性感染[11]。在子宫中感染，并见出生后死亡的仔猪常出现皮肤和内脏器官出血。一般情况下，怀孕早期出现感染时，对胎儿损伤的危险性高。先天性CSFV感染能造成木乃伊胎、死胎和畸形。CSFV对猪的淋巴组织有嗜性，而且导致猪免疫系统的损伤。在感染初期，CSFV会侵入猪的扁桃体以及其外周淋巴结的B滤泡和上皮细胞中，并在其内复制。随后CSFV进入淋巴结的其他部分，内皮及上皮细胞。另外，CSFV还感染并损伤淋巴组织的生发中心，阻碍B淋巴细胞的成熟，使在循环系统和淋巴系统组织中的B淋巴细胞丧失，病猪胸腺萎缩，白细胞减少，病猪的骨髓遭到破坏。在死胎仔猪中，最常见的变化为皮下水肿、腹水以及胸腔积液。畸形包括头和四肢发育不全，脑和肺不发育及脊髓发育不良。繁殖障碍型猪瘟由于临床症状不典型，发病情况不同，症状与发病特点变化差异较大，临床上与伪狂犬病毒和蓝耳病毒引起的繁殖障碍相似，因而很难做出临床诊断，必须作实验室诊断。龙岩市新罗区某存栏300头母猪的猪场，部分妊娠母猪发生早产或晚产、产死胎或2弱胎等繁殖障碍，弱胎猪多在2~3日龄时死亡，而同窝貌似正常的哺乳仔猪在7日龄以后逐渐出现拉稀、死亡现象，经问诊调查发病特点、临床症状和病理变化观察以及试验室PCR检测，确诊为猪瘟引起的繁殖障碍。1.发病情况调查1.1发病特点该猪场近2个月陆续发现将近40头初产和经产母猪流产、早产、死胎以及初生乳猪出生后短期内大批死亡的现象。该猪场曾在送检血样的45天前免疫猪瘟疫苗，3个月前免疫伪狂犬疫苗。母猪的猪瘟疫苗采用政府脾淋苗