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1科类农学编号（学号）20060755本科生毕业论文猪繁殖与呼吸综合征免疫球蛋白的制备Porcinereproductiveandrespiratorysyndromeimmunoglobulinpreparation张冬元指导教师：尹革芬职称副教授云南农业大学昆明黑龙潭650201学院：动物科学技术学院专业：动物医学年级：2006论文提交日期：2010年5月答辩日期：2010年6月答辩委员会主任：云南农业大学2010年6月2猪繁殖与呼吸综合征免疫球蛋白的制备张冬元（云南农业大学动物科学技术学院，昆明，650201）摘要猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）主要感染猪，尤其是母猪，该病严重影响其生殖功能，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀。垂直于水平传播都较为严重，尚无特效药，主要使用疫苗预防。然而接种疫苗会成为传染源。由（PRRSV）免疫球蛋白有高度的特异性，它的应用可高效的控制该病。本实验从兔血清中提取（PRRSV）免疫球蛋白，经过细胞实验，结果证实该产品效果良好。关键词：猪；PRRSV；免疫球蛋白。PorcinereproductiveandrespiratorysyndromeimmunoglobulinpreparationZhangdongyuan(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunNanAgriculturalUniversity,KunMing650201)ABSTRACT3Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)mainlyaffectspigs,especiallysows,thediseaseseriouslyaffecttheirreproductivefunction,clinicalcharacteristicsareabortion,stillbirth,mummified,weakchild,dyspnoea,theprocesswilltemporarypurpleskinoftheears.Verticaltransmissionaremoreserious,thereisnocureforthemainuseofvaccine，themainuseofvaccinestoprevent.However,vaccinationwillbecomeasourceofinfection.Becausethe(PRRSV)hasahighdegreeofspecificityofimmuneglobulin,itsapplicationcanbeeffectivecontrolofthedisease.Inthisstudy,extractedfromtherabbitserum(PRRSV)immuneglobulin,throughcellexperimentsrevealedthattheproducteffective.Keywords：swine；PRRSV；immunoglobulin.4猪繁殖与呼吸综合征免疫球蛋白的制备1引言猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）自二十世纪八十年代末期开始流行，1992年国际兽医局正式命名，主要感染猪，尤其是母猪，该病严重影响其生殖功能，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故又称为蓝耳病。该病在上个世纪八十年代末、九十年代初，曾经迅速传遍世界各个养猪国家，在猪群密集、流动频繁的地区更易流行，常造成严重经济损失。被我国归为II类动物疫病，近几年，该病在国内呈现明显的高发趋势，对养猪业造成了重大损失，已成为严重威胁我国养猪业发展的重要传染病之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒[1]归属动脉炎病毒科（Arteriviridae），动脉炎病毒属（Arteriviridae）。1991年荷兰中央兽医研究中心。从人工和自然感染病猪分离到病毒，命名Lelystad病毒（LV）病毒粒子呈卵圆形，直径50~65nm。在感染的肺泡巨噬细胞的超薄切片中，其直径为45~65nm的球状颗粒。有囊膜，20面体对称，为单股RNA病毒。病毒有2个血清型，即美洲型和欧洲型，我国分离到的毒株为美洲型。病毒对酸、碱都较敏感，尤其很不耐碱，一般的消毒剂对其都有作用，但在空气中可以保持3周左右的感染力。猪繁殖与呼吸综合征的主要感染途径为呼吸道，空气传播、接触传播、精液传播和垂直传播为主要的传播方式，病猪、带毒猪和患病母猪所产的仔猪以及被污染的环境、用具都是重要的传染源。此病在仔猪中传播比在成猪中传播更容易。当健康猪与病猪接触，如同圈饲养，频繁调运，高度集中，都容易导致本病发生和流行。猪场卫生条件差，气候恶劣、饲养密度大，可促进猪繁殖与呼吸综合征的流行。老鼠可能是猪繁殖与呼吸综合征病原的携带者和传播者。各种年龄的猪发病后大多表现有呼吸困难症状，但具体症状不尽相同。剖检猪繁殖与呼吸综合征病死猪，主要眼观病变是肺弥漫性间质性肺炎，并伴有细胞浸润和卡他性肺炎区，肺水肿，在腹膜以及肾周围脂肪、肠系膜淋巴结、皮下脂肪和肌肉等处发生水肿。5在显微镜下观察，可见鼻黏膜上皮细胞变性，纤毛上皮消失，支气管上皮细胞变性，肺泡壁增厚，膈有巨噬细胞和淋巴细胞浸润。母猪可见脑内灶性血管炎，脑髓质可见单核淋巴细胞性血管套，动脉周围淋巴鞘的淋巴细胞减少，细胞核破裂和空泡化[2]。母猪染病后，初期出现厌食、体温升高、呼吸急促、流鼻涕等类似感冒的症状[3]，少部分（2%）感染猪四肢末端、尾、乳头、阴户和耳尖发绀，并以耳尖发绀最为常见，个别母猪拉稀，后期则出现四肢瘫痪等症状，一般持续1～3周，最后可能因为衰竭而死亡。怀孕前期的母猪流产，怀孕中期的母猪出现死胎、木乃伊胎，或者产下弱胎、畸形胎，哺乳母猪产后无乳，乳猪多被饿死公猪感染后表现咳嗽、打喷嚏、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促和运动障碍、性欲减弱、精液质量下降、射精量少。生长肥育猪和断奶仔猪染病后，主要表现为厌食、嗜睡、咳嗽、呼吸困难，有些猪双眼肿胀，出现结膜炎和腹泻，有些断奶仔猪表现下痢、关节炎、耳朵变红、皮肤有斑点。病猪常因继发感染胸膜炎、链球菌病、喘气病而致死。如果不发生继发感染，生长肥育猪可以康复。哺乳期仔猪染病后，多表现为被毛粗乱、精神不振、呼吸困难、气喘或耳朵发绀，有的有出血倾向，皮下有斑块，出现关节炎、败血症等症状，死亡率高达60%。仔猪断奶前死亡率增加，高峰期一般持续8～12周，而胚胎期感染病毒的，多在出生时即死亡或生后数天死亡，死亡率高达100%[4]。由于该病的高发病率与死亡率，以及目前尚无比较特效的临床药物，目前该病以疫苗预防为主，一般情况下，种猪接种灭活苗，而育肥猪接种弱毒苗。因为母猪若在妊娠期后三分之一的时间接种活苗，疫苗病毒会通过胎盘感染胎儿；而公猪接种活苗后，可能通过精液传播疫苗病毒。并且不能进行紧急免疫[5]，由于存在上述原因所以（PRRSV）免疫球蛋白的应用就成为首选办法。由于目前国内未见报道（PRRSV）免疫球蛋白的报导，本实验将对这一薄弱环节进行弥补，并建立制做（PRRSV）免疫球蛋白的模型。2材料与方法2.1试验时间、地点本实验于2009年到2010年在云南农业大学动物科学技术学院动物传染病实验室完成。2.2实验材料62.2.1原料免疫原：为哈尔滨兽医研究所生产的（PRRSV）弱毒疫苗（购于云南省兽医总站）以及由云南农业大学动物科学技术学院动物传染病实验室分离纯化得到的（PRRSV）毒株（TCID50:10-4.5/0.1mL）；转移因子：实验室自制；健康成年兔若干：购于市场；实验细胞：非洲绿猴肾上皮细胞（Marc-145），由动物传染病实验室培养并保存。猪PRRSV快速诊断金标试纸条：“深圳市康百的生物科技有限公司”生产乳胶凝结实验试剂盒：“深圳市康百的生物科技有限公司”生产2.2.2试剂双蒸水、HCl(1mol/L)、NaOH(1mol/L（NH4）2SO4)、Na2HPO4、NaH2PO4、灭菌生理盐水。化学试剂均为分析纯，以上试剂均由云南农业大学动物科学技术学院动物传染病实验室提供)2.2.3设备超净工作台、水浴锅、移液枪、电炉、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、低温离心机、电子天平、细菌过滤器、生物倒置显微镜、CO2细胞培养箱、以及其他必要的实验室常规仪器。实验仪器均由农业大学动物科学技术学院动物医学动物传染病实验室提供。2.3实验方法2.3.1试剂的配置2.3.1.1饱和（NH4）2SO4的配置，称取（NH4）2SO4400-500g，以电炉加热蒸馏水（500ml）至50-80℃溶解，搅拌20min。趁热过滤。冷却后以浓氨水调pH至7.4。配好的饱和硫酸铵，瓶底应该有沉淀析出。2.3.1.2磷酸盐溶液（0.2mol/L）储存液配置配置A液为0.2mol/L的Na2HPO4，称取Na2HPO4·12H2O71.46g，加蒸馏水至1000ml。于容量瓶中配置，常温保存。配置B液为0.2mol/L的NaH2PO4，称取NaH2PO4·2H2O3.12g，加蒸馏水至1000ml。于容量瓶中配置，常温保存。2.3.1.3磷酸盐缓冲液（PBSpH7.4）0.02mol/L（应用液）取储存液A液81ml加B液19ml，再以灭菌生理盐水做10倍稀释即得。2.3.1.40.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBSpH7.4）应用液取储存液A液81ml加B液19ml，再以灭菌生理盐水做对倍稀释即得。2.3.2购买实验动物，观察其健康状态。动物正常后开始进行免疫。72.3.3免疫（本实验采用的注射方法均为多点皮下注射）2.3.3.1免疫程序分基础免疫和加强免疫两部分，在免疫中期每两周灌喂一次转移因子【6】。基础免疫首免二免1(首免后七天)二免2(二免1后七天)二免3（二免2后七天)1.5头份/只3头份/只3头份/只3头份/只基础免疫后进行抗体效价测定，乳胶凝结实验[7]结果为强阳性。见下图12.3.3.2加强免疫（于基础免疫后10天）加强1加强2加强3加强48头份/只1ml强毒1.5ml浓缩毒15头份/只免疫间隔为5-7天。每次免疫后进行抗体效价测定，待抗体效价达1：80（金标试纸条测量）后采血，试纸按使用说明使用。结果见下图2。图1图22.3.4采血2.3.4.1待体效价达到高峰值时准备屠宰采血，首先要常规保定，待宰兔颈部局部剪毛、冲洗、消毒，然后切开皮肤，分离组织充分暴露颈静脉，切断颈静脉，用胶管导流接血。放血前一天晚上停食，可饮水。2.3.4.2血液预处理自然凝血后离心得到血清，分离血清，分离得到血清后将其放置于56°处理30分钟[8]，灭活其可能对后续实验造成负面影响的生长因子，氨基酸等成分。将灭活后的血清中加入？？ml双抗。放置于4℃过夜。将血清分成2份，分别编号1号2号。球蛋白的提取目前使用效果较好的有白，常用的方法有盐析法(如多聚磷酸钠絮凝法，8硫酸氨盐析法)、有机溶剂沉淀法(如冷乙醇分离法、辛酸沉淀法)、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法、纤维素层析法、凝胶层析法、超滤法等【9】结果综合分析比对本实验采用硫酸铵盐析法2.3.5饱和硫酸铵盐析法提取免疫球蛋白2.3.5.1于超净工作台中取2号血清样品XmL，加入等体积的0．02mol/LpH7．4的PBS缓冲液，搅拌均匀，向其中缓慢加入饱和硫酸铵溶液2Xml，边加边搅拌，静置过夜，使其充分沉淀。将上述溶液于4℃下4000r／min离心20min，弃去上清液。2.3.5.2用PBS溶解沉淀物至a，然后再向其中缓慢加入饱和硫酸铵溶a/2体（所得硫酸铵浓度为33%）搅拌均匀静置过夜。再于4℃下4000r／min离心20min离心。2.3.5.3重复上一步1-2次2.3.5.4沉淀物用少量PBS液溶解，装入透析袋。2.3.5.5除盐常规除盐效果较好的有液相色谱分析，超滤，柱层析，交换吸附等[10]。经各方面的综合比对本实验