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1河南农业职业学院论文题目：鹅血清及卵黄中IgG的测定学生姓名：王乐乐学号：110580专业年级：高牧11-52013年4月22日目录2鹅血清及卵黄中IgG的测定学生：赵冬冬专业：畜禽生产教育2004级指导教师：郎仲武摘要：免疫球蛋白G（ImmunoglobulinG，简称IgG）指具有抗体活性的动物蛋白。在禽类，母代可以通过卵子将自身的免疫球蛋白传递给子代，对子代起到保护作用[20]。本试验应用ELISA对102枚吉林白鹅种蛋进行检测，检测项目为鹅胚发育过程卵黄中IgG和鹅胚血清中IgG的含量。结果表明，鹅胚血清中和卵黄中IgG含量是，14.5日龄为0.1717μg/mL和3967.62μg/mL，34.5日龄（出壳3.5天）日龄为1495.6413μg/mL和2821.363μg/mL。关键词：鹅;免疫球蛋白G;ELISA1前言卵黄抗体即卵黄免疫球蛋白就是卵黄中的γ—卵黄球蛋白，由于其蛋白质的物理化学性质、免疫学性质等方面与哺乳动物免疫球蛋白存在一定差异[1，2]，所以在免疫学领域把由禽卵黄中获得的抗体称为卵黄免疫球蛋白(ImmunoglobulinofYolk，简称IgY)[3]。IgY的用途是非常广泛、多样的，其中最重要的功能是由母体传递IgY给新生儿提供被动地免疫保护力。IgY普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类，在功能上等价于哺乳动物IgG，但其许多生物学性质仍未被发现。免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是指免疫系统受抗原刺激后,B细胞转化为浆细胞而产生的具有抗体活性,能与相应的抗原发生特异性结合的球蛋白,或指化学结构与抗体相似的球蛋白。它广泛存在于机体的血清、体液及粘膜分泌液中,是构成机体体液免疫的主要物质，免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE[4，5]。禽类已确证的免疫球蛋白有三种：即IgG（IgY）、IgM和IgA[6]。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，约占动物血浆丙种球蛋白的70%，分子量约15万，含糖2～3%。IgG具有提高免疫力、增强机体抵抗力3等作用。目前国内尚没有定量检测鹅IgG的相关报道。本文应用酶联接免疫吸附剂测定法(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，简称ELISA)对鹅血清及卵黄中的IgG含量进行了测定，现将结果报告如下。2材料与方法2.1试验材料2.1.1试验动物吉林白鹅种蛋购于吉林省某种鹅场2.1.2主要试剂磷酸氢二钠分析纯北京化工厂磷酸二氢钠分析纯北京化工厂牛白蛋白（生化试剂）分析纯上海新兴生物有限公司氯化钠分析纯北京化工厂饱和硫酸氨Sephadex—G200分析纯北京鼎国生物有限公司辣根过氧化物酶分析纯北京鼎国生物有限公司鹅IgG、鼠抗鹅IgG抗体、兔抗鹅IgG酶标抗体为本实验室自制2.1.3仪器与设备恒温箱、电子天平；40孔聚苯乙烯酶标反应板；XYJ80－1台式离心机；LD4－2A低速离心机；北京医用离心机厂；磁力搅拌器（78－1型磁力加热搅拌器）分光光度计751C型；酶联免疫检测仪DG—3022型；孵化器；冰箱；酸度计pHS-3C；ELISA板。2.2实验方法2.2.1鹅血清IgG的提取取健康吉林白鹅的混合血清20mL，加生理盐水20mL，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10mL，使成为20％（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30min；3000rpm离心20min，弃沉淀；在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30mL，使成50％（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30min；离心20min，弃去上清；于沉淀中加入20mL生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液10mL，使成33％（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30min；3000rpm离心20min，弃去上清，以除去白蛋白，重复3次；用10mL生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次，直至完全除去SO42﹣或NH4﹢离心去沉淀；离心去沉淀（去除杂质蛋白）上清液即为粗提的IgG；将G200凝胶活化、浮选、装柱，以0.01mol∕LpH7.4PBS液洗脱、平衡。并向其中4加入上一步中所提取的粗提的IgG样本，以PBS液洗脱，收集第二蛋白洗脱峰，浓缩即为精提IgG。2.2.2鹅血清及卵黄参考阴性与参考阳性的选择及制备2.2.2.1鹅血清参考阴性的制备取吉林白鹅血清5份充分混合（4ml/份），取此混合液20mL，加生理盐水20mL，充分混合，逐滴加入35％饱和硫酸铵，边加边搅拌，混合均匀后静置30分钟，然后3000转/分钟离心20分钟，弃去沉淀，上清装入透析袋，常水流水透析12小时，然后生理盐水透析24小时，其间换液数次。最后将提取液浓缩至原体积，重复3次。分装冻存于－20℃冰箱。2.2.2.2鹅血清参考阳性的制备取吉林白鹅血清5分，混合（该血清取自制备参考阴性血清的吉林白鹅），分装冻存于－20℃冰箱。2.2.2.3鹅卵黄参考阴性的制备无菌取卵黄5份，充分混合，取此混合液20mL，蒸馏水10倍稀释，用稀酸调节至PH5.2，8000转/分钟离心。蒸馏水稀释沉淀至卵黄原体积，将卵黄、生理盐水、氯仿按1:2:2混合，混匀后置室温2h，2000克离心力离心20min，分成三相，油相、水相、固相，弃去水相，然后将油相与固相充分混合，室温下挥发掉氯仿，蒸馏水稀释至原体积。蒸馏水稀释7倍，分装冻存与-20℃冰箱中[8]。2.2.2.4鹅卵黄参考阳性的制备无菌取卵黄5份，充分混合，蒸馏水7倍稀释（该卵黄取自制备参考阴性卵黄的种蛋），分装冻存于－20℃冰箱中。2.2.3双抗体夹心ELISA试验各反应条件的确定2.2.3.1包被抗体工作浓度确定用0.01mol/LpH9.5的碳酸盐缓冲液将小鼠抗鹅IgG稀释成5µg/mL、10µg/mL、20µg/mL、30µg/mL、40µg/mL、50µg/mL、60µg/mL、70µg/mL、80µg/mL分别包被酶标反应板，对鹅血清100倍稀释进行ELISA检测。2.2.3.2被检鹅血清的最佳稀释倍数的确定按包被抗原的工作浓度将抗原稀释，包被酶标板，然后将混合鹅血清，分别用0.1％牛血清白蛋白的PBST液作40、50、60、70、80、90、100、200、400倍稀释，每个稀释5度加五孔，进行ELISA检测并计算出每个稀释度的平均OD值（490nm）。选择OD值最接近于1时被检鹅血清的稀释倍数作为被检鹅血清的最佳稀释倍数。2.2.3.3待检鹅卵黄最佳稀释倍数的确定按包被抗原的工作浓度将抗原稀释，包被酶标板，然后将混合鹅卵黄，分别用0.1％牛血清白蛋白的PBST液作4、8、10、16、20、32、64、100倍稀释，每个稀释度加五孔，进行ELISA检测并计算出每个稀释度的平均OD值（490nm）。选择OD值最接近于1时被检鹅卵黄的稀释倍数作为被检鹅血清的最佳稀释倍数。2.2.3.4按包被抗原的工作浓度将抗原稀释，包被酶标板，然后分别将五份卵黄混合，分别用0.1％牛血清白蛋白的PBST液作1、2、4、8、10、16、20、32、64、100倍稀释，每个稀释度加五孔，进行ELISA检测并计算出每个稀释度的平均OD值（490nm）。选择OD值最接近于1时被检鹅卵黄的稀释倍数作为被检卵黄的最佳稀释倍数。2.2.3.5最适抗原包被时间的确定分别将小鼠抗鹅IgG包被后于37℃3h、4℃过夜、37℃3h后4℃过夜，进行测定，观察结果。2.2.3.6最适抗原抗体反应时间的确定将抗原抗体分别作用37℃60min、90min、120min，进行测定。2.2.3.7最适酶标抗体作用时间的确定酶标抗体作用时间分别为37℃60min、90min、120min，进行测定。2.2.3.8最适底物作用时间的确定底物反应时间分别为37℃15min、30min、45min，进行测定，观察结果。2.2.4阳性判定值的确定ELISA检测方法在结果判断上是定性测定，对受检标本分别用“阳性”、“阴性”表示。根据国家流行病学调查要求，阳性OD值应为阴性4倍。2.2.5ELISA检测方法的检验2.2.5.1敏感性试验将5份成年鹅血清的混合液以0.1％牛血清白蛋白的PBST液作50、60、70、80、90、100、200、400倍稀释，按照已建立的ELISA进行检测，测定OD值，确定鹅血清的敏感反应滴度。2.2.5.2重复性试验6选取数份鹅血清及鹅卵黄，按建立的ELISA进行五次检测，测定其OD值变化，观察结果。2.2.5.3特异性试验以小鼠抗鹅血清包被反应板，成年鹅血清20份，与未用鹅IgG免疫的小鼠血清包被反应板对比，检测其OD值。3结果3.1鹅IgG及其抗体制备结果鹅IgG经饱和硫酸铵法粗提后，进行Sephadex-G200层析，所获得的收集液体，用751分光光度计计算蛋白含量，根据所得的OD值（280nm）绘制曲线如下图所示：图1Sephodex-G200纯化鹅IgGFig1.Purificationofgoose’sIgGwithSephodexG200经Sephadex－G200纯化鹅IgG所获得的曲线图可知，第一峰和第二峰出现的间隔很小，所以在收集洗脱液时，只从第二峰左侧收集蛋白OD值大于0.25的洗脱液至第二峰右侧OD值大于0.2的洗脱液。然后将此收集液浓缩，并计算蛋白含量[9，10]。用751分光光度计测得OD280和OD260值并按下式计算蛋白浓度，蛋白浓度(mg/mL)=(OD280×1.45-OD260×0.74)×稀释倍数。计算鹅IgG蛋白蛋白含量为10.7318mg/mL。3.2双抗体夹心ELISA检测方法的建立3.2.1被检鹅血清参考阳性与鹅卵黄参考阴性的最佳稀释倍数的确定Sephodex-G200纯化鹅IgG00.10.20.30.40.50.61357911131517192123252729313335373941管号蛋白含量（ug/mL）蛋白含量7表4被检血清的最佳稀释倍数的确定Table4Determinationofserumdilution孔号12345678稀释倍数481016203264100血清平均OD值1.311.261.271.261.241.161.100.98血清参考阴性平均OD值0.310.290.290.280.240.240.210.19由以上表可知，将血清100倍稀释时，其OD值最接近1.0，参考阴性为0.19，符合P/N＞4，因此，在检测时将血清100倍稀释。3.2.2被检鹅卵黄参考阳性与鹅卵黄参考阴性的最佳稀释倍数的确定表5被检卵黄的最佳稀释倍数的确定Table5Determinationofyolkdilution孔号12345678稀释倍数481016203264100卵黄平均OD值1.21.091.060.10.970.730.670.44卵黄参考阴性平均OD值0.360.310.250.240.210.150.120.09由以上表可知，将卵黄进行20倍稀释时，其OD值最接近1.0，参考阴性为0.21，符合P/N＞4，因此，在检测时将卵黄20倍稀释。3.2.3最适底物作用时间的确定表6最适底物作用时间Table6Resultsofvariousincubatedtimeofsubstrate孔号123处理方法20min30min45min平均OD值0.831.021.22底物反应时间分别为37℃15min、30min、45min，进行测定后，试验结果表明，当底物的作用时间30min时，初乳的OD值为1。因此将底物作用时间确定为30min。3.2.4IgG敏感性试验结果在血清中，当已知含量的鹅IgG稀释至0.0683594μg/mL时，OD值不再有变化。表7血清敏感性试验结果Table7ResultsofsensitivityexperimentforserumIgG含量8.7504.3752.1881.0940.5470.2730.1380.068.03420.0178(μg/mL)平均OD值0.760.680.620.