76第九章 基因组学基础pdf-1

1第九章基因组学(Genomics)基础第一节PCR原理与应用第一节基因组结构特征第二节DNA分子标记及其应用第三节基因组图谱的构建及应用第四节后基因组学2有关基因组学的重要事件1900年,孟德尔遗传学被重新发现;1905年，Bateson定名“遗传学”（Genectics）;1909年，Johannsen提出了“基因”（gene）一词;1920年，H.Winkler提出了“基因组”（genome）一词，用以代表一个生物的一组染色体所包含的全部基因;3有关基因组学的重要事件1953年，DNA双螺旋结构发现后，使基因组的研究从染色体水平进入了分子水平，有力地推动了基因组研究的发展;1986年，美国的H.Roderick提出了基因组学Genomics一词，从此基因组学正式成为一门科学。4有关基因组学的重要事件1990年，启动人类基因组计划；1995年，完成了第一个原核生物（细菌）基因组的测序测定；1996年，完成了第一个真核生物（酵母）基因组的测序；1998年，完成了第一个多细胞生物（线虫）基因组的序列测定；5有关基因组学的重要事件2000年，完成了果蝇和拟南芥的基因组测序以及人类的基因组草图；2002年,完成了水稻的基因组草图绘制；2003年,完成了人类全基因组测序；2005年,完成了水稻基因组全序列测定。6人类全基因组测序RICE果蝇和拟南芥线虫细菌酵母人类基因组计划7ƒGenetics遗传学(Bateson1905)ƒGene基因(Johannsen1909)ƒGenome基因组(Winkler1920)ƒGenomics基因组学(Roderick1986)891011目录第一节PCR原理与应用第二节基因组结构特征第三节DNA分子标记及其应用第四节基因组图谱的构建及应用第五节后基因组学12第一节PCR原理与应用13第一节PCR原理与应用一、PCR的定义二、PCR技术发明的历史三、PCR的基本原理四、PCR的反应条件五、PCR的应用14第一节PCR原理与应用一、PCR的定义PCR(polymerasechainreaction)即多聚酶链式反应，是一种DNA体外扩增（DNAamplification）技术。它是利用特异模板DNA、1对特定引物、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、缓冲液和盐在体外合成（扩增）特定DNA片段。15二、PCR技术发明的历史PCR技术是由美国Cetus公司人类遗传实验室的MullisK.B.等人于1983年发明的。K.B.Mullis第一节PCR原理与应用16ƒPCR发现的几个重要事件：1983年春天的想法。经过三个月断断续续的实验，终于在圣诞节前成为现实。12月16日，第一次成功地完成PCR实验。1984年，申请发明专利；1985年，在Science上发表简短的报导；1986年，在美国冷泉巷实验室年会上报告；第一节PCR原理与应用171987年，完成了PCR的自动化装置（PCR仪）；1991年，与DuPont公司对簿公堂；1993年，获诺贝尔奖。第一节PCR原理与应用18ƒ与DuPont对簿公堂：1987年，DuPont找Cetus，希望获得PCR的授权。Cetus说“不”。1991年，正当“沙漠风暴”席卷伊拉克时，DuPont与Cetus在加利福尼亚联邦法院的法庭上，摆开了对阵的架势。DuPont认为，PCR早就发明了，PCR的发明权不属Cetus。第一节PCR原理与应用19ƒDuPont的证据主要是：（1）Kornberg早在1957年就发现了聚合酶。Kornberg出庭作证，那时谁想做PCR都能做，Mullis只是第一个需要做这种试验而已。（2）Kleppe于1971年提出了体外合成DNA的原理。（3）Panet等1974年对DNA体外复制作了描述，并有做试验的打算。第一节PCR原理与应用20ƒCetus反驳：（1）Kornberg在1983年出版的《DNA复制》教科书，并没有关于PCR的论述，说明那时还没有这方面的知识。（2）到1989年，关于PCR的文章有2000多篇，没有1篇怀疑PCR是在1985发展起来的。第一节PCR原理与应用21ƒ审判持续了两个月。最后，Cetus以58票对0票胜诉!第一节PCR原理与应用227272℃℃9494℃5555℃℃PCRPCR循环循环23三、PCR的基本原理（一）体内DNA复制的原理第一节PCR原理与应用242526分子标记272829（二）PCR的基本原理模板DNA在高温下解链成为单链模板，人工合成的寡核苷酸引物在低温条件下与模板DNA链互补结合，DNA聚合酶在适温条件下将单核苷酸从引物3’端开始掺入，沿模板5’→3’方向延伸，合成DNA新链。第一节PCR原理与应用30ƒ其主要步骤是：高温(94°C)变性：置待扩增DNA于高温下解链成为单链模板。低温(55-58°C)退火：人工合成的两个寡聚核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合。适温延伸：DNA聚合酶在72°C将单核苷酸从引物3’端开始掺入,沿模板5’→3’方向延伸，合成DNA新链。931变性变性变性变性变性变性变性5‘5‘3‘3‘3‘3‘5‘5‘第一轮合成出的DNA新生链的长度不确定第二轮开始形成特定产物特定产物含量倍增30轮228(2.7×109倍)3233四、PCR的反应条件ƒ（一）PCR反应液:ƒ10xPCRbuffer2.5ƒ15mMMgCl22.5(可变)ƒ1mMdNTP5.0ƒTaq(1u)1.0(可变)ƒPrimer(100ng/μl)1.0x2ƒGenomicDNA(20ng/μl)5.0ƒH2OxƒTotal25.0(μl)ƒƒ10xPCRbuffer：500mMKClƒ200mMTris-HCl（pH8.2）ƒ0.01%gelatin（明胶）第一节PCR原理与应用34ƒ（二）PCR反应循环：PCR循环按高温变性、低温退火和适温延伸的原理设计所用的温度和时间。94°C4’-10’1cycle94°C1’37-55°C1’25-40cycle70-75°C2’72°C5’-10’1cycle第一节PCR原理与应用35模板模板DNADNAdNTPdNTP引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板DNADNAdNTPdNTP引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶9494ooC5C5’’PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(1)(1)36PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(2)(2)TaqTaq酶酶模板模板DNADNAdNTPdNTP引物引物BufferBuffer循循环环仪仪9494℃℃5555℃℃7272℃℃TaqTaq酶酶模板模板DNADNAdNTPdNTP引物引物BufferBuffer7272℃℃55～～7min7min37琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(3)(3)38（三）影响PCR的因素：PCR方法操作简单，但影响的因素较多，欲得到好的反应结果，需要根据不同的情况，摸索最适条件。A．模板B．引物C．Mg++浓度D．dNTP浓度E．TaqDNA聚合酶用量F．循环参数第一节PCR原理与应用39ƒ影响酶活性的因素：TaqDNA聚合酶的最适反应温度为70°C。TaqDNA聚合酶活性对Mg++的浓度非常敏感，是Mg++依赖性酶。在MgCl2为2.0mM的条件下，酶的活性显示最高。KCl的最适浓度是50mM，高于75mM时，聚合反应受到抑制。第一节PCR原理与应用40引物设计原则：（1）引物长度以15-30个碱基为宜，（G+C）含量约50%，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列；（2）避免引物内部形成二级结构；（3）两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，避免形成“引物二聚体”；（4）引物的3’端应为G或C。第一节PCR原理与应用41MarkerPrimerforwardPrimerreverseRM1gcgaaaacacaatgcaaaaagcgttggttggacctgacRM2acgtgtcaccgcttcctcatgtccgggatctcatcgRM3acactgtagcggccactgcctccactgctccacatcttRM4ttgacgaggtcagcactgacagggtgtatccgactcatcgRM5tgcaacttctagctgctcgagcatccgatcttgatggg第一节PCR原理与应用42（四）PCR产物的检测和多态性分析：PCR产物通常在琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，在紫外光下观察。PCR产物通常以共显性的带型出现。第一节PCR原理与应用4344五、PCR的应用（一）生命科学1、基因组计划2、后基因组计划3、物种的分类、进化及亲缘关系第一节PCR原理与应用45（二）农业科学1、转基因动植物2、动植物分子育种第一节PCR原理与应用46（三）医药1、疾病的诊断和治疗遗传性疾病；老年性疾病；癌基因的检测和诊断；基因治疗。2、致病病原体的检测包括细菌、病毒（SARS及禽流感病毒H5N1等）、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。第一节PCR原理与应用473、DNA指纹、个体识别（DNA身份证）、亲子关系鉴别和法医物证4、生物工程制药5、转基因动物制药及疾病模型6、中药材真伪鉴别第一节PCR原理与应用48（四）环境科学1、环境生态研究2、环境监测用于物质的生物地球化学循环、环境过程的生物作用、生物多样性及有机物源判断等方面的研究。49（五）考古学及历史事件解读利用人类短串联重复STR-PCR技术，研究人类种族的遗传多态性。目前此技术已广泛用于生物考古、种系发育、民族学、人类学和考古学等各个领域中。第一节PCR原理与应用50（六）卫生安全1、食品微生物的检测主要用于：食品致病菌的检测，如肉毒唆菌等；乳酸菌的检测；水中细菌指标测定。2、转基因食品的检测3、动、植物检疫灵敏、特异、快速诊断是否携带烈性传染病（艾滋、动物病毒、植物病毒等）病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等第一节PCR原理与应用51第二节原核和真核生物基因组结构的特征一、原核生物基因组结构的特征二、真核生物基因组结构的特征52第二节原核和真核生物基因组结构的特征常识和问题：1、DNA位于染色体上。2、基因是一段DNA片段。3、基因位于染色体上。534、基因有哪些？基因是怎么排列的（基因组结构）？5、位于染色体上的DNA除组成基因外，是否还有非基因成分？如何排列？结构基因、调控基因、tRNA基因、rRNA基因、合成组蛋白的基因、转座基因、细胞器基因、假基因54什么是基因组和基因组结构？基因组（genome，1922）：即基数染色体组。近年来，基因组（genome）更多定义为整套染色体中所包含的全部基因。55基因组结构：特定单位DNA在染色体上的排列方式。具体来讲，各种基因和一些特殊序列的DNA片段在染色体上的排列方式。56基因组大小生物基因组大小/Mb人3000拟南芥100水稻565小麦1700057一、原核生物基因组结构的特征1.原核生物基因组通常较小(5Mb)。染色体是由一个核酸分子（DNA或RNA）组成的，DNA（RNA）呈环状或线性。可能含有质粒。基因组结构的特征58ƒ2.功能相关的基因大多以操纵子形式出现。如大肠杆菌的乳糖操纵子等。操纵子是细菌的基因表达和调控的一个完整单位，包括结构基因、调控基因和被调控基因产物所识别的DNA调控原件（启动子等）。基因组结构的特征5960大肠杆菌基因组中，绝大多数基因都以操纵子（operon）方式组合成表达单位。操纵子含有一组彼此相邻的结构基因，基因间隔可以只有1-2bp。大肠杆菌总共有600个操纵子，每个含2个或更多的基因。613.蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在。一般而言，为蛋白编码的核苷酸顺序是连续的，中间不被非编码顺序所打断。基因组结构的特征62634.编码tRNA和rRNA的基因通常是多拷贝的。ƒ：编码tRNA的基因645.转座因子65二、真核生物基因组结构的特征1.真核生物基因组通常较大(1