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Real-timePCR实验步骤北京协和医学院阜外心血管病医院心外科心血管病国家重点实验室吴益和实验中必须坚持的一些好习惯总的注意事项：1.加入试剂之前,把它混刀一下,以免放置时间长了浓度不均2.移液枪用完之后要归到昀大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性3.所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因一、防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2.异硫氰酸胍：目前被认为是昀有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中，昀关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染：RNA酶昀主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理动植物总RNA提取-Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。在收集到生物材料之后，昀好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2、将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30℃下放置5分钟；然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；3、取上层水相（离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%）于一新的离心管，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温（15℃～30℃）放置10分钟，12000g（2℃～8℃）离心10分钟。【如果希望分离DNA或蛋白质，保留中层和下层酚-氯仿相，有机相能保存在4°C一夜】4、弃去上清液（RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁），按每1mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇进行洗涤，涡旋混刀，4℃下7500g离心5分钟【RNA能够在–20°C保存在75%乙醇中至少1年，4°C保存至少1周】5、小心弃去上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会使RNA失去溶解性，导致A260/280ratio1.6。6、加适量Rnase-freewater溶解RNA沉淀，用枪头反复吸取混刀，55–60℃水浴10-15min。进行下游实验或-70℃保存备用。7、RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。预计的总RNA产量：[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值2、加氯仿前的刀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。总mRNA的提取(自己的经验)一.关于TrizolReagent需要的试剂1．Chloroform：氯仿(分析纯)2．Isoproplylalcohol：异丙醇(分析纯)3．75%Ethanol（inDEPC-treatedwater）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。4．RNase-freewater：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃3小时）5．一次性塑料手套6．注意：DEPC有致癌之嫌7.抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280ratio<1.6。8.分离组织10mg（纯组织）加800ulTrizol试剂。二.DEPC处理方法如下：1.DEPC处理（1）DEPC水：100ml超纯水加入0.2mlDEPC，充分混匀，高压灭菌。（2）Tip头(枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μlTip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000ml超纯水加入1mlDEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。2.提取RNA，用DEPC水溶解3.RT我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。4.操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%DEPC水，再灭菌就行了；现在有进口的RNASEFREE的枪头买，直接用不用处理的三.如何消除污染机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。（1）试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。（2）加样：原则是DNA昀后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均刀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，昀容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNAN-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。四.RNA定量RNA也昀好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。RNA的贮藏，昀主要的是温度，-20不够，昀好-80，液氮昀保险mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响五.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量六.mRNA的分离与纯化中步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNAPoly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。七.下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法：保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000ng的RNA加入至0.5ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。八.PCR污染与对策1.PCR扩增产物污染这是PCR反应中昀主要昀常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。还有一种容易忽视，昀可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.1).标本处理区，包括扩增摸板的制备；2).PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；3).产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度2.反应液污染可采用下列方法之一处理：1).DNaseI法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI，室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；2).尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。a、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。b、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处理还有什么意义呢？还要用双蒸水洗吗？c、玻璃器皿干烤：180度，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。RNA提取一.RNA提取前的准备1.研钵的处理1)自来水反复冲洗；2)去污剂或者洗涤灵冲洗；3)自来水反复冲洗；4)蒸馏水浸泡1~2d；5)超净工作台内用无水乙醇冲洗2~3遍，晾干。