单细胞凝胶电泳

实验十七单细胞凝胶电泳技术——丁书茂单细胞凝胶电泳技术——丁书茂•单细胞凝胶电泳技术(singlecellgelelectrophoresis,SCGE)，也称彗星试验(cometassay)，是OstlingO和JohansonKJ首次提出，后经Singh等进一步完善的一种在单个细胞水平上检测DNA损伤、交联和修复的方法。因其简单、灵敏、低耗、快速等优点而广泛应用于生物检测、遗传毒理、流行病学调查等诸多方面。一、实验原理•DNA链多为磷酸复合物，在生理条件下DNA的多聚核酸链多呈阴离子状态，当外源性因素（如紫外照射）造成DNA链断裂时，负超螺旋结构变得松散，那么在电场作用下DNA就会以一定速率向正极移动。•在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等结构受到破坏，胞内蛋白质、RNA及其它成分均扩散到溶液中，而核DNA由于分子量大而只能留在原位。•经碱处理和在碱性电解质的作用后，DNA解旋，损伤的DNA断链及其片段会被释放出来，而在电泳条件下，DNA片段可进入凝胶孔隙发生迁移。由于这些DNA分子量很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向正极移动，形成彗星状的图像。•在一定条件下，DNA迁移距离和DNA含量分布与DNA损伤程度呈线性相关。随着DNA损伤程度加剧，断片数目增加，表现为尾部DNA含量增加，彗尾延长，荧光强度加强。二、实验流程采用碱性SCGE，其基本操作过程包括：1.细胞制取•取处于对数生长期的Hela细胞，吹打为单细胞悬液，用PBS调节细胞密度为105-106个/ml。2.细胞染毒•染毒组：取1ml细胞悬液加入10-3MH2O2溶液50μl，混匀，37℃水浴30min；•阴性对照组：取1ml细胞悬液加入50μlPBS缓冲液，同等条件下水浴30min。3.制片•第一层胶：在完全磨毛的载玻片上铺180μL质量分数为1%的正常熔点琼脂糖(NMA)，室温固化10min；•可将玻片用吹风机稍微加热，以延缓琼脂糖凝固。•第二层胶：取50μL质量分数为0.8%的低熔点琼脂糖（LMA）和30μL的细胞悬液，混匀后滴加于第一层胶上，加该盖片使其均匀铺开，4℃凝固10min；•第三层胶：移开盖片，滴加100μL质量分数为0.5%的LMA于第二层胶上，加盖片，4℃凝固10min。4.裂解•将制好的凝胶放入冷的裂解液中，4℃下裂解2小时；•裂解液使用时新配(铺完第二层胶后即可配制)90mllysissolution10mlDMSO1mlTriton-X1005.解旋•从裂解液中将载玻片取出，在蒸馏水中洗去过多盐，晾干。•将新配制的电泳缓冲液倒入电泳槽中，约覆过载玻片0.25cm，盖上盖子，在高pH电泳缓冲液中放置20min以便DNA解螺旋。6.电泳•室温下调节缓冲液液面高低，于20V，200mA下电泳20min。7.中和•将凝胶浸入0.4MTris缓冲液（pH7.5）中，浸洗30min。8.染色观察•用20μg/L的吖啶橙染色3－5min，用双蒸水洗掉表面的染料，24小时内在荧光显微镜下观察。三结果观察050100150253035404550TailDNA%H2O2浓浓05010015046810121416182022TailmomentH2O2浓浓四注意事项•实验操作均在红光或暗处条件下进行，以避免造成DNA的额外损伤。•关键步骤是铺胶，尤其是第一层胶，一定要平整，均匀。若有气泡，用下一层胶填平。•配制裂解液时，DMSO为致癌剂，注意安全。用去尖的枪头取Triton-X100五思考题•试分析三层胶浓度不同的原因。•试分析影响单细胞凝胶电泳实验结果的因素。