白血病微小残留检测及其质量控制

1上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory白血病微小残留检测及其质量控制上海市临床检验中心徐翀上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory白血病微小残留的概念MRD（MinimalResidualDisease)是指白血病患者经过诱导缓解治疗，并按目前所确定的疗效标准取得完全缓解（CR）后体内残留的微量白血病细胞MRD是造成白血病复发的根源。上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory白血病微小残留检测的意义早期预报白血病复发当患者MRD检测持续阳性或负荷逐渐增多，则可判断该患者可能出现复发。上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory白血病微小残留检测的意义指导缓解后治疗化疗药物具有很强的毒性由于个体差异，不同患者的白血病细胞对化疗药物的敏感性不同根据不同个体对药物的敏感性调整用药的方案个体化治疗MRD是反映白血病细胞对化疗药物作用的敏感性的最直接客观指标,MRD检测是个体化治疗的基础。上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryElaineCoustan-Smith,etal.Clinicalimportanceofminimalresidualdiseaseinchildhoodacutelymphoblasticleukemia.Blood.2000,96(8):2691-2696上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryRubnitzJ,etal.Minimalresidualdisease-directedtherapyforchildhoodacutemyeloidleukaemia:resultsoftheAML02multicentretrial.Lancet.2010,11:543-5522上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory白血病微小残留检测的意义指导干细胞移植MRD的检测将有助于判断合适的移植时机，提高移植成功率，减少复发率。上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory白血病微小残留检测方法的选择近20年来的研究表明，当机体内白血病细胞数低于106时，则有可能依靠机体自身的免疫保护机制清除体内残留的白血病细胞。这意味着适合于急性白血病MRD检测的技术敏感度至少需要达到10-4，即在10000个正常细胞中可以检出1个白血病细胞。能达到10-4敏感度的方法只有流式细胞术和PCR方法上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory聚合酶链反应（PCR）检测MRD1.融合基因上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory融合基因优点：在整个病程中，断裂点融合区十分稳定缺点：大部分白血病患者缺乏特异的含有断裂点融合区的染色体异常，故方法具有局限性上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory聚合酶链反应（PCR）检测MRDIG和TCR基因重排结合部序列上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryIG和TCR基因重排结合部序列优点：在ALL中覆盖面广，可以对绝大多数ALL患者进行MRD监测缺点：由于白血病细胞中重组酶的活性较强，造成一些靶序列如IgH基因重排会发生进一步重排，从而造成假阴性3上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory流式细胞术相对于PCR的优点1.快速、简便2.流式细胞术是直接进行定量，更为精确；而PCR是根据产物的量进行推算。3.流式细胞术检测时可以区别活细胞和经化疗将要死亡的细胞以及死亡细胞的碎片（而这些死亡的细胞以及细胞碎片在PCR检测中都可能形成阳性信号）。上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory流式细胞术检测白血病MRD原理利用抗原表达的差异，以直观的方式区分白血病细胞和正常的骨髓细胞（正常生理状态下和骨髓重建期）跨系表达的抗原质的差异时相混乱的抗原与染色体异常相关的抗原抗原表达量异常高量的差异抗原表达量异常低差异上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryALLMRD检测的抗体组合St.JudeChildren’sResearchHospital上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryALLMRD检测的抗体组合PLucio,GGaipa,EGvanLochem,etal.Leukemia.2001,15:1185-1192（欧洲BIOMED-1合作组织）B-ALL上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryALLMRD检测的抗体组合APorwit-MacDonald,EBjorklund,PLucio,etal.Leukemia.2000,14:816-825（欧洲BIOMED-1合作组织）T-ALL上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryAMLMRD检测的抗体组合St.JudeChildren’sResearchHospital4上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryMRD检测的质量控制1仪器状态的确认⑴对激光管、滤光片、对数和线性放大器和光电倍增管的性能进行校验，同时也包括光路校准。时间间隔：每6个月1次。对于光路校准，临床型（stream-in-cuvette）为6月1次，分选型（stream-in-air）为每次操作应校准。执行人员：有资质的售后维修服务人员方法：由维修服务人员掌握上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryMRD检测的质量控制⑵监测流式细胞仪的工作状态，确认已发生的和潜在的问题。时间间隔：每次启动机器（冷启动）执行人员：仪器操作人员方法：在已建立的适当的仪器工作条件（instrumentsettings,instrumentset-up）下，观察并记录所用的标准（参考）荧光微球如Flowcheck,Calibratesbeads的所有重要参数的平均荧光通道值。可以利用Levey-Jennings图表判断记录数值的趋势和变异，判断每次的记录值是否在可接受限度内。如果任何一个值在可接受限度之外，必须重复监测；若问题仍存在，则需要调整仪器的条件设置。FACSCalibur用户必须做timedelay校准。上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryMRD检测的质量控制（3）荧光颜色补偿条件的确认时间间隔：至少每次检测临床标本前执行人员：仪器操作人员方法：建议优先使用荧光抗体染色和未染色的的新鲜全血标本，荧光标记微球和空白微球的使用次之。a.标记抗体的荧光素和标记微球的荧光素的光谱特性稍有区别。b.以荧光标记微球和空白微球调整补偿设置，会导致轻微过补偿。上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryMRD检测的质量控制BasicElementsofDailyQCAlignmentCheckFluorescentStandardProcess/MethodControlPASSRunPatientPatientAnalysisObtainResultsGenerateReportTestReimbursementTroubleshootMaintenanceFAILCallServiceFixProblemColorCompensation上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryMRD检测的质量控制2分析前质量控制（1）标本采集标本种类：骨髓，外周血。(不同的临床意义）抗凝剂：EDTA-K3，Heparin，ACD-A，需充分混匀（2）标本运送生物安全：视同具有传染原的标本对待。标本运送条件：室温（18－22℃），立即送检上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryB-ALL骨髓和外周血MRD结果比较DarioCampana实验室对226例ALL患儿716对骨髓和外周血标本进行了MRD检测和对比：T-ALL患儿35对标本，外周血和骨髓结果完全一致。B-ALL患儿有104份骨髓标本MRD结果阳性，但只有37份对应的外周血标本MRD结果阳性。5上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratory上上海海市市临临床床检检验验中中心心ShanghaiCentreforClinicalLaboratoryShanghaiCentreforClinicalLaboratoryB-ALL骨髓和外周血MRD结果比较对65例患儿的5年复发率进行统计：外周血MRD阳性患者中80%复发；而仅骨髓MRD阳性患者中13%复发