细胞凋亡检测

（一）测原理细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。（二）用价值流式细胞仪检测有下列特点：（1）检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确；（2）可用许多相关分析；（3）结合被测细胞DNA含量分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期。但该法周样也具有标本制作复杂。非原位检测，不易与变性细胞鉴别等因素的限制。1.检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，采用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。常用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有拒染性，荧光着色很浅，凋亡细胞主要摄取hoechs-PI染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈红色荧光。2.DNA片段原位标记凋亡细胞DNA片段原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate,UDTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidy1transferase,TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3'的羟基（-OH）端相结合经显色反应后检测DNA裂解点的技术。DNA片段原位标记法有两种：（1）原位缺口转移（insitunick-translation,ISNT）技术，该技术是1994年由Fehsel等提出，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸接到断裂的3'-OH端；（2）原位缺口末端原位标记技术（insituendlabellingtechnique,ISEL）,该技术即TUNEL法,于1993年由Wijsman等提出，它是利用TdT将标记DUTP接到3'-OH端。研究证明，TUNEL的敏感性远高于尤其对早期凋亡的检出TUNEL更为适用。其原因可能是凋亡发生时DNA大多是双链同时断裂而单链断裂少见。ISNT是依赖DNA多聚酶I的单链修复反应，故阳性率较低。细胞凋亡时DNA断裂早于形态学改变及DNA含量减少。因此该法较前述各法具有更高的灵敏性，但环死细胞亦有DNA裂点形成。因此环死亦可呈TUNEL阳性反应。3.检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法（1）检测原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外侧。磷脂酰结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的亲合力。因此，AnnexinV可以作为控针检测暴露在细胞膜表面的PS。故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV,将AnnexinV标记上荧光素，同时结合PI拒染法进行凋亡细胞双染后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。（2）结果判断：正常活细胞AnnexinV、PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染；坏死细胞AnnexinV、PI均高染。（3）应用价值：细胞发生凋亡时，膜上PS外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联全PI染色法不需固定细胞,可避免PI染色法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法固定造成的DNA片段丢失。因此，AnnexinV联合法PI更省时，结果亦更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。细胞凋亡的几种检测方法来源：生命经纬　一、形态学观察方法1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。二、DNA凝胶电泳（一）、检测原理细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。（二）结果判断正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。（一）检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。（二）用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。四、流式细胞仪定量分析（一）检测原理细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。（二）应用价值流式细胞仪检测具有以下特点：1)、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确2)、可以做许多相关性分析3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧光。■DNA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。DNA片段原位标记法有二种：1、原位缺口转移（insitunick-translation,ISNT)技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3·－OH端2、原位缺口末端标记技术（insituendlabellingtechnique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。■检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV，将AnnexinV标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。2、结果判断：正常活细胞AnnexinV、PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染；坏死细胞AnnexinV/PI均高染。3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，AnnexinV联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3?ˉ-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(TerminaldeoxynucleotidylTransferaseTdT)可以将地高辛标记的dUTP(DIG-dUTP)标记至3’-OH末端，DIG-dUTP(核苷酸)结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)反应后，再结合链酶亲和素-过氧化物酶(SABC)，然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡的细胞核呈棕黄色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。试剂1.标记缓冲液(LabelingBuffer)5×浓度的TdT反应缓冲液，含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾。pH7.210mmol/LCoCl2(氯化钴)1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)3.DIG-dUTP(×20)4.封闭液(BlockingReagent)5.生物素化抗地高辛抗体(×100)6.SABC(×100)7.ProteinaseK(×200)8.抗体稀释液9.多聚赖氨酸或APES。10.0.01MTBS,PH7.5(配法：1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠，1.2克Tris和0.45-0.5ml纯乙酸。)11.DAB显色试剂。操作步骤1.样品处理(1)玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。(2)细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛/0.01MPBS(PH7.0-7.6)室温下固定30-60分钟。0.01MPBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。(3)组织：有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01MPBS(PH7.0-7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水(脱蜡务必干净)。2.新鲜配制3%H2O2，室温处理10分钟。蒸馏水洗涤2分钟×3次。3.标本片加0.01MTBS1:200新鲜稀释ProteinaseK37℃消化5-15分钟，0.01MTBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-30分钟)。4.标本片加标记缓冲液(LabelingBuffer)20μl/片，以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl，加入18μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。5.0.01MTBS洗2分钟×3次。6.加封闭液50μl/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体：(取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl)，混匀后50μl/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30分钟。0.01MTBS洗2分钟×3次。8.用抗体稀释液1:100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC10μl，混匀后50μl/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01MTBS洗5分钟×4次9.DAB显色。10.苏木素轻