细胞凋亡检测技术

细胞凋亡及检测技术第一节概述一、细胞凋亡的概念细胞凋亡(apoptosis〉，这是1972年Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体(apoptoticbodies〉，而被其他细胞吞噬。“凋亡”一词来自希腊语，apo意为“分离”，ptosis指花瓣或树叶的脱落，“凋亡”是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡的形态类似秋天花瓣或树叶的凋落一样。二、研究简史半个世纪前:人们就观察到在生物的发生、生长、发育以及衰老过程中，一直伴随着组织细胞的生理自发退化死亡现象.1965年:发育生物学家Lockshin和Williams首先提出了PCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程，认为随着成年蛾的出现，其幼虫死亡是一种发育调节性死亡。1972年:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念，从形态学角度描述细胞的生理死亡，并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象，可能具有十分重要的生物学意义。1977年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象，可能具有十分重要的生物学意义。1980年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等。1989年:0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中，发现T细胞受体(TCR)与自身抗原相互作用与未成熟T细胞的PCD发生有关，并在体外证实剌激CD3分子可诱导未成熟T细胞PCD的发生。证明了信号传递物质对PCD的调控作用。1991年:Ellis首先发现了线虫(C.elegans)体内Ced-3、4两个基因与PCD的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因，前者包括Ced-2、p53、c‐myc、Fas、糖皮质激素受体及白细胞介素1β转化(ICE〉等基因，后者则有Ced-9、bcl-2、p53等基因.三、细胞凋亡的特征细胞凋亡与细胞坏死虽然都是细胞死亡，但细胞凋亡的形态及生化特征与坏死性细胞死亡的特点则不同（一）细胞凋亡的形态学改变：组织内单个细胞或小团细胞的死亡不引发细胞自溶，也不引起炎症反应电镜下可见：凋亡细胞固缩胞浆致密，细胞器密集、退变核染色质致密，聚集于核膜处胞核裂解，胞浆形成多发性芽突凋亡小体形成光镜下：凋亡小体外被以胞膜，圆形或卵圆形，胞浆浓缩，强嗜酸性，可有可无固缩深染的核碎片。细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别细胞凋亡细胞坏死单细胞丢失细胞膜发泡但仍完整,细胞膜内陷将细胞分割成凋亡小体不发生炎症反应被临近正常细胞或吞噬细胞吞噬溶酶体完整染色质均一凝集细胞成群丢失细胞膜不完整,细胞肿胀、溶解发生严重炎症反应被巨噬细胞吞噬溶酶体裂解染色质凝集成块、不均一细胞坏死时核的变化细胞坏死时的炎症反应(二)细胞凋亡的生化改变：凋亡过程中出现的生化改变以DNA的片段化及蛋白质的降解最为重要。1)DNA的片段化组成染色质的DNA链被激活的核酸内切酶切割，可形成180—200bp或其整倍数的片段，电泳中呈特征灶的“梯”状条带，这是判断凋亡发生的客观指标之一。2)蛋白质的降解凋亡蛋白酶激活，水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体并形成凋亡小体、水解相关活性蛋白，从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别细胞凋亡细胞坏死生理因素诱导非生理因素造成的意外损伤受大分子合成和激活过程的严格调控离子稳态调节丧失需要能量不需要能量需要大分子合成不需要核酸和蛋白质的合成有新基因从头转录没有新基因转录染色质非随机降解为DNA“梯带”染色质DNA随机降解四、细胞凋亡的过程与调控凋亡信号转导凋亡基因激活细胞凋亡的执行凋亡细胞的清除(一)凋亡的四个阶段：凋亡诱导因素+受体cAMPCa2+神经酰胺死亡信号凋亡基因激活DNase激活Caspase激活巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞（二）细胞凋亡的调控1.细胞凋亡的相关因素（1）诱导性因素激素和生长因子失衡：缺乏（IL-2↓，淋巴细胞凋亡）或过多（糖皮质激素↑，淋巴细胞凋亡）理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等免疫性因素：如，CTL分泌粒酶→靶细胞凋亡微生物因素：细菌、病毒及毒素。（HIV）（2）抑制性因素：细胞因子：IL-2、神经营养因子激素：ACTH、睾丸酮、雌激素等二价金属阳离子：Zn2+药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨基酸病毒：EB病毒、牛痘病毒CrmA2.细胞凋亡信号转导凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。凋亡信号转导系统的特点：①多样性：不同种类细胞有不同系统②耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节交、耦联，同一因素既可引起凋亡也可引起增殖③同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统④多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统研究较多的系统：依据：①细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升②用Ca2+载体A23187人为升高B淋巴细胞Ca2+水平，B淋巴细胞凋亡③用Ca2+络合剂降低胞内Ca2+水平，阻止细胞凋亡激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶Ca2+↑活化核转录因子1．胞内Ca2+信号系统（Ca2+为第二信使）2．cAMP/PKA信号系统（cAMP为第二信使）依据：①双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡②糖皮质激素使cAMP上升cAMP↑→激活PKA→使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝AA）残基磷酸化→改变蛋白质功能3．Fas蛋白/Fas配体信号系统Fas蛋白：细胞膜跨膜蛋白Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）→细胞凋亡机制：①Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）→神经鞘磷脂酶活性↑→产生神酰胺→蛋白激酶激活→细胞凋亡②Fas蛋白+抗Fas、TNF→激活ICE样caspase→降解H1组蛋白→染色体松驰→DNA暴露内切酶位点③通过Ca2+信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡4．神经酰胺信号系统神经酰胺：神经鞘磷脂（SM）在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理u937白血病细胞，诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、TNF-α、Fas抗原、糖皮质激素5．二酰甘油/蛋白激酶C（PKC）信号系统二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产生的一种第二信使物质。依据：①活化的PKCβ1可诱导u937白血病细胞凋亡②抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡③PKC激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖皮质激素、T细胞受体激活、IL-2撤除）6．酪氨酸蛋白激酶系统生长因子或细胞因子→激活酪氨酸蛋白激酶→靶蛋白酪氨酸磷酸化→Ras蛋白激活→通过Raf-1、MAPKK、MAPK→蛋白质磷酸化→细胞分化生长因子或细胞因子撤除→不能激活酪氨酸蛋白激酶系统→细胞凋亡3.凋亡相关基因三类：抑制凋亡基因：Bcl-2、EIB、IAP促进凋亡基因：P53、Bax、ICE双向调节基因：c-myc、Bclx(B细胞淋巴瘤/白血病-2[Bcelllymphoma/leukemia-2]基因的缩写)Bcl-2蛋白：229个氨基酸（人）、236个氨基酸（小鼠）分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜作用：Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡依据：①导入Bcl-2基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导的凋亡②淋巴细胞有20%呈Bcl-2阳性时，预后不佳（耐受放射线、抗癌药物）1.Bcl-2①直接的抗氧化作用②抑制线粒体释放促凋亡蛋白质（细胞色素C、AIF）③抑制促凋亡性调节蛋白质Bax、Bak的细胞毒作用④抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活⑤维持细胞钙稳态Bcl-2抗凋亡作用机制：作用：野生型（wtP53）：DNA结合蛋白，诱导细胞凋亡（“分子警察”）突变型：抑制细胞凋亡野生型P53的作用机制：P53蛋白→细胞周期G1期检查染色体DNA损伤（检查点功能）→发现DNA损伤→剌激CIP的表达→阻止细胞进入下一周期，启动DNA修复机制→修复失败→启动细胞凋亡机制→细胞凋亡2.P53c-myc:一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双向调节作用。作用机制：c-myc蛋白为重要的转录调节因子，既可介导细胞增殖的基因，也可激活介导细胞凋亡的基因，其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生长因子→增殖，无生长因子→凋亡）。Bcl-x：能翻译Bcl-XL和Bcl-Xs两种蛋白，Bcl-XL蛋白抑制细胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促进细胞凋亡（合成以谁为主）3.c-myc,Bcl-x五、细胞凋亡的发生机制（一）氧化损伤氧化损伤的后果之一：细胞凋亡依据：①各种氧化剂（H2O2）可直接诱导细胞凋亡②抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可诱导细胞凋亡③抗氧化剂（VitE、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（TNF-а、电离辐射）引起的细胞凋亡①引起DNA损伤，激活P53基因②引起DNA损伤，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭NAD，消耗大量ATP③攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产生过氧羟基24碳四烯酸④激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶⑤细胞膜损伤，Ca2+内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜电位改变⑥活化核转录因子NF-кB、AP-1，加速凋亡相关基因表达氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：（二）钙稳态失衡细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一依据：①各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程②凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）③钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退行性疾病）①激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链②激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成③激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达④Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：（三）线粒体损伤线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜电位（△ψm）下降，能量代谢水平显著降低线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用依据：①抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡②在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨膜电位（△ψm）下降③阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（Bcl-2）线粒体改变引起细胞凋亡的机制：Ca2+NO缺血原卟啉Ⅸ活性氧线粒体△ψm下降Bcl-2(-)PTP开放Apaf+Cyt.CCaspase-9酶原Caspase-9(+)Caspase-3酶原Caspase-3(+)Caspase抑制剂AIF(-)蛋白质水解细胞凋亡DNA断裂无活性核酸内切酶核酸内切酶激活(+)(+)第二节细胞凋亡的检测方法细胞凋亡检测方法：归纳起来，可分三方面，即根据凋亡的形态学特征、细胞凋亡的生化特征以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。本节主要介绍细胞凋亡的常用病理学检测方法。一、苏木精-伊红染色方法(HE染色)1．石蜡组织切片HE染色（略）2．细胞爬片或细胞涂片的HE染色（1）细胞爬片或细胞涂片的制备：贴壁生长细胞(包括肿瘤细胞)：让细胞生长在盖玻片使其在上面爬行生长。取出盖玻片，经PBS轻轻漂洗后，用4%的甲醛或多聚甲醛在常温下固定5－10min，即可染色。悬浮生长细胞(包括肿瘤细胞)或贴壁生长的细胞经消化脱壁成单细胞悬液后，可经细胞涂片后染色。（2）染色方法:同石蜡组织切片HE染色，免去第1和第2步。【结果判断】1.光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等。2.在细胞爬片上，凋亡的细胞变圆、变小，可见细胞核固缩、碎裂，染色体被