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第七章转基因动物一、动物转基因技术的基本概念二、外源基因导入动物体内的研究方法三、动物转基因的载体四、动物转基因的应用五、克隆动物转基因动物转基因动物（transgenicanimal)：指动物基因组中整合有用转基因技术所导入的外源基因（或特定的DNA片段），整个技术则称为转基因技术(transgenictechnology或transgenesis)。理论上讲任何动物都可以通过性系基因操作成相应的转基因动物（如：鱼、鼠、羊、牛等）。转基因动物1、1982年，R.D.Palmiter等采用显微注射法，将大鼠生长基因导入小鼠受精卵的雄原核内，得到转基因小鼠以来，成功构建了各种转基因动物。2、转基因动物技术具有广泛的应用：研究基因的表达与功能，生产生物大分子；生产人体蛋白；改良动物；医用转动物模型。3、转基因人的研究只能限于体细胞的基因治疗，具有遗传特征修饰的转基因人的研究，可否迈出历史的一步？问题多多。4、动物基因转移无论用何技术，转移效率极低。第一个转基因鼠携带了生长激素基因的转基因鼠转基因动物一、动物转基因技术的基本概念1.外源目的基因的分离；2.外源基因与载体相连；3.将外源目的基因重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞；4.接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育（胚胎转移技术，ET）；5.移植后的受精卵发育生长为后代，胚胎发育生长鉴定及筛选；6.利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。（一）动物转基因技术的程序动物基因转移的起点和终点分别为受精卵和含有整合转基因的动物子代。在这个过程中，转基因的效率极低。以小鼠转基因为例：以小鼠转基因为例：注射外源基因后受精卵的存活率为86％；将受精卵移殖到母鼠子宫内后受精卵的存活率为25％；母鼠的怀孕率为80％；转基因在基因组上的整合率为24％；因此小鼠转基因的总有效率约为4％。（二）动物转基因的效率1.基因组片段：分子较大，保持较完整的基因结构。2.融合基因：将不同来源的结构基因、非编码序列、表达调控序列重组成杂合单元。3.小基因：分别取同一基因的某一区域或若干区域组成转基因。4.插入基因：含有在动物染色体上随机或特异性插入位点，可装标记基因。5.置换基因：两侧含动物基因或其他DNA区域的同源序列。（三）动物基因的结构1.转基因的时空特异性表达动物基因表达调控的显著特性：时空特异性，特别是在发育过程中，相关基因的时序特异性和组织特异性表达更为严格。2.转基因的可控表达诱导动物细胞内的转基因，对其稳定高效表达至关重要，转基因的诱导条件取决于受体细胞的性质和启动子的类型。3.转基因的共抑制效应在转基因动物体内，转基因的表达常会发生转基因的失活，也称为转基因沉默。（四）动物基因的表达特性1.共抑制只发生在转基因与同源的内源性基因之间，对其他的基因表达不产生影响；2.如果转基因与内源基因发生体内重组，则共抑制效应随之消失，基因表达恢复正常；3.共抑制现象的发生与结构基因的编码区有关，但不依赖于启动子的来源和性质。4.两个相同的转基因之间也能发生共抑制效应。（五）共抑制效应共抑制效应的特征1.转基因与其同源的内源性基因相互作用，形成某种状态而影响两者表达；2.转基因与内源基因竞争性结合核基质和核包膜上转录翻译必须的非扩散元件，导致相互抑制；3.两者转录出互为反义的RNA结构，使之失活并迅速降解；4.由于转基因的存在，受体细胞中mRNA的大量积累，并激活某些未知酶系的表达，导致mRNA降解。（五）共抑制效应造成共抑制效应的原因转基因动物体内的转基因表达单方面失活，而同源的内源性基因却表达正常。1.转基因被受体细胞识别为异己DNA，并将它甲基化修饰，使其失活；2.转基因整合在不合适的染色体部位，受局部条件影响而不表达；3.转基因本身的结构不利于其表达。（六）转基因表达单方面失活的原因1.人类与老鼠共享着80％的遗传物质和99％的基因，人类和老鼠基因组同源度高，对它进行比较研究可以得知很多关于人类疾病和生理机能的研究，因此了解老鼠非常有助于了解人类本身。（七）为什么选择鼠作为转基因动物模型1.奶汁可以由乳腺不断地分泌，而且产量很高，长期收集也不会对动物造成伤害；2.将新的药物蛋白限制在乳腺内生产，最后分泌到乳汁中，一般不易对转基因动物的正常生理活动造成影响；3.乳腺分泌的蛋白质是经过正常的高等哺乳动物的翻译后加工的，这使得生产的药物蛋白更接近于人类自身的蛋白质；4.乳汁中蛋白纯化起来相对较为容易，而且在乳汁中含有的其他蛋白质也为数不多。（七）为什么选择乳腺来生产药物蛋白奶牛和绵羊乳汁的蛋白质组成蛋白质种类奶牛乳汁蛋白含量(g/L)绵羊乳汁蛋白含量((g/L)αsl酪蛋白αs2酪蛋白κ酪蛋白β酪蛋白α乳清蛋白β乳清蛋白血清清蛋白溶菌酶乳铁传递蛋白免疫球蛋白10．03．43．910．01．03．00．4痕量0．10．712．03．84．616．00．82．8（七）为什么选择乳腺来生产药物蛋白1.应用于动物基因组结构与功能的研究(1)以报告基因为转基因探测动物或人基因组中时空特异性表达调控序列；(2)以反义基因为转基因灭活相关的内源基因，构建基因表达缺陷——功能丧失的动物模型；(3)以同源基因为转基因体内检测其表达特性及产物的生物效应。2.转基因技术改良动物物种3.对人体中数千种分子病的基因治疗4.利用此技术构建优异的动物反应器由于鼠的生殖周期短，产仔数多，基因整合率较高。饲养成本较低，因此成为转基因动物实验的首选动物。（八）动物转基因的意义二、动物转基因的基本研究方法最早发展并较为完善的系统是小鼠进行转基因实验；从20世纪80年代初期到现在，人们已经将上百种不同的基因转人了小鼠，这些研究为进一步了解高等动物的基因表达调控、肿瘤的发生、免疫特异性、胚胎发生、发育过程以及分子遗传学等基础生物学过程做出了重要贡献；同时，在判断利用家畜生产人类药物的可行性、构建人类各种遗传疾病的生物医学模型方面，转基因鼠也发挥了重要的作用。动物转基因技术的基本研究方法一、利用反转录病毒载体将外源基因转入胚胎早期细胞，然后移植到受体动物中；二、利用显微注射法将DNA直接注射入受精卵的精前核中；三、将基因工程改造过的胚胎干细胞导入早期胚胎中。用该方法已成功地得到了猪、羊、鸡、免、牛、鱼等多种转基因动物。动物转基因技术的基本方法在各种动物转基因技术中，通过逆转录病毒载体把外源基因整合到受体细胞核基因组中是目前最有效的方法之一。一、逆转录病毒法一、逆转录病毒法通过逆转录病毒载体法获得转基因小鼠1.反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(＜10kb)。转入的基因易缺少其邻近的调控序列。2.反转录病毒载体因缺失了复制功能序列，在复制载体DNA所用的辅助病毒(helpervirus)基因组也可能与目的基因一起整合到同一细胞核中。另外转基因动物自身也有可能产生辅助病毒株。3.目前的技术水平要完全杜绝反转录病毒在转基因动物商品中的污染是很难做到的。一、逆转录病毒法逆转录病毒法的缺陷用显微注射器把DNA直接注射到动物的细胞质或细胞核中（直接注射和穿刺导入法）。受体细胞：1）多为沿培养皿壁生长的单层细胞；2）动物的卵细胞。转化效率：取决于注射DNA性质和注射技巧。二、显微注射法向供体雌鼠注射怀孕母马的血清，48h后再注射人的绒毛膜促性腺激素，处理的雌鼠可以产约35个卵细胞/次（正常雌鼠只能产5—10个卵细胞/次）。从交配后雌鼠体内取出受精卵。外源基因注射进受精卵。微注射的转入基因常要删除原核载体序列的线性DNA。在哺乳动物中，精子进入卵细胞后的lh内，精前核和卵细胞的核都是分开的。等到卵细胞核完成减数分裂，成为卵前核时，核融合才进行，这称为核配。DNA微注射要在精前核时注射才能有效。精前核比卵前核更大，因此可在显微镜下找到处在精前核状态下的受精卵。二、显微注射法（1）二、显微注射法（1）注射完成后，用显微外科手术将25—40个受精卵移植到假孕雌鼠的子宫内，制造雌鼠假孕（可以让它与切除了输精管的不育雄鼠交配），将受精卵移入代孕母鼠子宫中大约3周后，接受过注射的受精卵发育生长为幼鼠，由代孕母鼠产下。二、显微注射法（2）假孕母鼠二、显微注射法（2）转基因动物进行检测：（1）取一小截幼鼠的尾巴，提取DNA进行Southern杂交或PCR检测，看是否存在转入基因。（2）将它与另一只鼠进行交配来确定转入基因是否存在其生殖系中。（3）通过对子代进行杂交产生纯合的转基因鼠。二、显微注射法（3）■，转基因杂合鼠；口，未转基因鼠显微注射法获得转基因鼠的纯合系通常发育成转基因动物的受精卵一般占注射受精卵的5％。大多数情况下通过微注射法获得转基因动物的成功率只有l/1000。对于显微注射用的DNA的要求高：1）转入的外源基因要能够高效表达；2）可以诱导表达；3）具有帮助提高整合效率的序列。在注射的载体中加上MAR序列(matrixattachregion)，这种序列位于染色体的基部，具有隔离作用，可以帮助基因高效表达；4），在外源基因两端可加入微卫星序列，因在染色体上也有微卫星序列，两个微卫星序列可以帮助发生同源重组，提高整合效率。二、显微注射法（4）用显微注射法获得的几种转基因动物的成活率转入基因的结构示意图由于微注射法所注射的DNA在宿主基因组中是随机整合的，因此转入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，从而干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢；有的外源基因的表达具有时间性，得到的转基因动物可能只在一段时期内表达外源基因；有些个体可能因基因插入位点不合适而无法表达产物；还有些个体基因拷贝数过多导致表达过量，干扰自身的正常生理活动。因此，并不是所有的转基因小鼠都能产生预期的性状。由于这些原因，DNA显微注射法的总效率还是比较低，但是这种方法仍然是目前获得转基因鼠的常规方法。二、显微注射法（4）多能胚胎干细胞：动物胚泡发育期的胚细胞重新导入另一胚泡期的胚之后，它仍然保持着分化成其他类型细胞的能力，这种细胞叫做多能胚胎干细胞。胚胎干细胞(embryonicstemcell，简称ES细胞)的获得：分离胚泡的内层细胞团(innercellmass)进行培养。ES细胞在无饲养层的平板中培养时会持续分化为肌细胞、神经细胞等多种功能细胞，只有在含有成纤维细胞的饲养层或白血病抑制因子(1eukemiainhibitoryfactor，LIF)的饲养层上生长时，才能保持其未分化状态，保持ES细胞的潜在分化能力。三、胚胎干细胞法从鼠的胚胎细胞培养胚胎干细胞1.在ES细胞的培养过程中，可通过基因工程操作，利用反转录病毒载体、电击法等多种方法将外源基因导人ES细胞，而不改变它的分化能力。2.将有功能的转入基因整合到ES细胞基因组内的某一非必需基因位点上，然后对这些细胞进行筛选培养，用于产生转基因动物。3.这种方法避免了在DNA微注射法与反转录病毒载体方法中存在的基因随机整合的问题。三、胚胎干细胞法通过胚胎干细胞获得转基因小鼠示意图PCR法检测是否特异整合同源重组示意图1.正确整合的转基因胚胎干细胞系经培养后就可以移入胚泡期的胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，这样产生的子代其部分生殖系细胞就是由转基因的ES细胞形成的。然后在得到的转基因鼠间进行杂交，子代再配对杂交。2.根据孟德尔遗传定律，将有1／4的可能获得纯合的转基因鼠，即转入基因可以和正常基因一样分离。三、胚胎干细胞法ES法遗传学分析1.目前，利用ES细胞获得的转基因小鼠主要是用于基础研究。从原理上讲，胚胎干细胞法应当也适用于获得其他转基因动物，但遗憾的是，这种方法目前还没有在牛、羊、猪及鸡等家畜、家禽的研究中使用；2.利用ES细胞获得转基因动物的方法还有一个缺点，就是需要经过多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产仔数较少的大型哺乳动物来说，如牛、羊等，要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。三、胚胎干细胞法ES法评价第七章转基因动物三、动物转基因载体1.病毒载体2.反转录病毒载体三、动物转基因载体1.有能够被真核细胞识别的有效的启动