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抗原抗体反应IgG为单体分子，是血清和细胞外液中含量最高的Ig血清中的IgM为五聚体，因此血清IgM水平升高提示有近期感染，有助于感染性疾病的早期诊断。抗原抗体反应的原理：①抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的；②抗原和抗体的结合完全依靠非共价键的相互作用，并且抗原复合物和游离成分之间保持动态平衡；③抗原抗体的结合使电荷减少或消失，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。范德华引力提供的作用力最小，疏水作用力提供的作用力最大。亲和力：是指抗体分子上一个抗原结合位点与对应的抗原表位之间相适应而存在着的引力，它是抗原抗体间固有的结合力。抗体超变区与抗原表位之间分子空间构型的吻合程度影响着抗体亲和力。吻合程度越高，亲和力越高。亲和力可用亲和常数KA来表示：KA=K1/K2=【Ab-Ag】/【Ab】×【Ag】（KA表示抗原抗体结合的稳定性和亲和力；K1表示结合常数；K2为解离常数；【Ab-Ag】表示抗原抗体复合物的摩尔浓度；【Ab】或【Ag】分别表示游离的抗体或抗原结合位点的摩尔浓度）KA值越大，【Ab-Ag】浓度越大，亲和力越高，抗体与抗原结合越牢固，反之抗原抗体复合物就容易解离。带现象：在等价带前后分别为抗体过剩或抗原过剩，形成的沉淀物少或无，这种现象在免疫测定中称为带现象。出现在抗体过量时，称为前带；出现在抗原过量时，称为后带（概念）改变pH和增加离子强度是最常有的促解离方法抗原抗体的纯化差速离心的分离效果是粗分离，适用于分子量相差大、不稳定、易变形的物质。常用于分离细胞器和病毒。常用的中性盐是硫酸铵，其优点是：①溶解度大；②温度系数小；③密度小；④价廉易得高浓度盐析法是由于盐分子与蛋白质分子极化部位相互作用，降低了蛋白质分子的亲水性而将其分级分离，是粗纯样品的重要方法盐析法是纯化蛋白质常用的粗提方法凝胶层析是利用物质的相对分子量不同而达到分离的一种层析技术。常用的凝胶有：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。纯化抗血清先用盐析法粗提，再用亲和层析法纯化。亲和层析的原理是利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。亲和层析一次纯化即可得到很纯的物质。常用的载体有纤维素、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃珠等。免疫原和特异性抗体的制备多克隆抗体制备与操作要点：1、抗原的制备与纯化2、佐剂的制备3、佐剂与Ag的乳化4、动物的选择5、动物的免疫（时间、剂量、途径）6、试血7、采取并收集血清8、血清的纯化、鉴定、保存（可溶性抗原，颗粒性抗原物2、3）免疫间隔时间是抗血清制备中的重要因素，一般第一次免疫后间隔时间以10-20d为宜。第二次后每次的间隔一般为7-10d颗粒性抗原用静脉注射，如抗原极为宝贵可采用淋巴结内微量注射法，抗原只需10-100ug即可获得较好的免疫效果同抗原一起或预先注射到机体内，能增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质，称为免疫佐剂，简称佐剂在抗血清制备中应用佐剂的目的是:为了提高抗原的免疫原性，从而增强体液免疫和细胞免疫的水平，获得高效价抗体。弗氏完全佐剂（CFA）是：石蜡油+羊毛脂+卡介苗弗氏不完全佐剂（IFA）是：石蜡油+羊毛脂HAT培养基的组成与作用：（重要）组成：HAT培养基是由入次黄嘌呤（hypoxanthine,H）、氨基蝶呤(aminopterin,A)、和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)组成作用:氨基蝶呤（A）为叶酸拮抗物，用以阻断细胞合成DNA的主要途径；次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）提供核苷酸合成的前体，使细胞能通过替代途径合成DNA有限稀释法：最终使每个培养孔内平均含有1个细胞（理论上，实际每孔是0个或1个或2个）目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和层析法沉淀反应常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺等Fabey曲线，适用与小分子抗原和较短时间（24h）的结果处理对流免疫电泳（CIEP）是将双向免疫扩散与电泳相结合，在直流电场中加速定向扩散的双向免疫扩散技术。对流免疫电泳原理：在pH8.6的琼脂凝胶中，抗原蛋白等电点（4-5）较低，带较多的负电荷，且分子较小，向正极的泳动速度大于向负极的电渗，抗原泳向正极；抗体蛋白等电点较高，带较少的负电荷，且分子较大，向正极的泳动速度小于向负极的电渗，抗体泳向负极。免疫电泳的原理：先利用区带电泳将样品中不同的抗原蛋白质分子在琼脂凝胶内分离成若干区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应抗血清，与已分离的抗原在琼脂凝胶内作双向免疫扩散，各种抗原与抗体特异结合，在二者比例合适处形成弧形沉淀线，分析样品中所含抗原成分及其性质。免疫电泳的用途：①纯化抗原或抗体的成分分析②正常和异常体液中蛋白质组成分析③不同抗体成分的研究免疫浊度测定的基本原理：是抗原、抗体在特殊缓冲液中反应而又比例合适（抗体过量）时，形成的小分子可溶性免疫复合物（＜19S）在增浊剂的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（＞19S），使反应液出现浊度。在抗体过量且固定的条件下，形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增强，即待测抗原量与反应后溶液的浊度呈正相关。伪浊度形成的原因（解答）：（重要）⑴标本：浑浊、高血脂、长期保存或反复冻融、处理不当⑵试剂：①抗体效价低于1：20会增加伪浊度；②抗血清灭活处理；③抗血清含有交叉反应性抗体；④PEG浓度过高引起血清中杂蛋白的非特异性共沉；⑤试剂污染和变质⑶器材：不够清洁、尘埃污染等⑷其他：缓冲液的离子类型与强度、pH及反应温度等都对浊度形成影响凝集反应间接凝集抑制试验的原理及判断：原理：是指已知抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体为诊断试剂，检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原判断：先让标本与抗体试剂反应，然后加入抗原致敏的载体，若不凝集，则说明待测标本中含有与致敏抗原相同的抗原，与已知抗体结合，而使载体颗粒游离，凝集反应被抑制，间接凝集试验为阳性；出现凝集现象，说明标本中不存在与致敏抗原相同的抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原结合，间接凝集试验为阴性。红细胞作为载体的间接凝集试验，又称被动血凝试验：凡红细胞沉积与孔底，呈一光滑圆点时为不凝集，判为阴性少部分红细胞沉于孔底，圆点周围有较松散的片层凝集，面积较小，判为++为“++”凝集孔作为试验滴度的终点。胶乳凝集试验属于间接凝集试验胶乳凝集试验分为玻片法和试管法，玻片法大多用作定性试验；试管法可作半定量测定胶乳试验的敏感性不及血凝试验抗球蛋白试验又称Coombs试验，用于检测抗红细胞不完全抗体。不完全抗体多半是7S的IgG类抗体直接Coombs试验，用于检测已粘附在红细胞表面的不完全抗体间接Coombs试验，用于检测在血清中游离的不完全抗体协同凝集试验：（填空、选择、解答）（原理）金黄色葡萄球菌细胞壁中含有的A蛋白（SPA）具有与IgG（IgG3除外）的Fc段结合而不影响Fab段活性的特性，利用金黄色葡萄球菌与IgG抗体的连接作用制成致敏载体所进行的凝集试验即为协同凝集试验。（属于反向间接凝集试验）补体测定和补体结合试验50%绵羊红细胞溶血法：原理：绵羊红细胞与相应抗体结合成的复合物可活化补体经典途径，使补体C1-C9相继在红细胞表面发生级联反应而形成跨膜小孔，细胞外水分渗入，导致红细胞胀裂而发生溶血。当红细胞和溶血素量一定时，溶血程度与补体活性呈正相关。曲线呈“S”形判断：在30%-70%溶血率之间，曲线最陡，几乎呈直线，补体量的微小变化就可使溶血率发生很大改变。血清总补体活性（CH50）测定的影响因素：补体的溶血活性与反应成反比外，随着pH、离子强度的增加，补体的溶血活性逐渐下降。Ca2+、Mg2+可稳定溶血系统，但过量反而抑制溶血反应。CH50溶血活性，与各个补体成分的蛋白含量之间并无完全的相关关系，该方法简便快速，但敏感性和重复性较差。补体结合试验分属三个系统：1、反应系统，包括已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）；2、补体系统、3指示系统，包括绵羊红细胞和相应抗体直接补体结合试验的原理：若反应系统中抗原与抗体特异结合，形成的抗原--抗体复合物能将同时加入的补体激活，消耗掉补体。当再加入指示系统时，反应液中已无游离ut，不出现溶血，为补体结合试验阳性，待检标本中含有已知抗原（或抗体）相应抗体（或抗原）。反之，为补体结合试验阴性。血清标本遇有抗补体想象是，可用系列方法处理：1、加热提高1-2℃；2、-20℃冻融后离心去沉淀；3、3mmol/L盐酸处理；4、白陶土处理；5小白鼠肝粉处理酶免疫技术均相法：是利用Ab-E与Ag结合形成Ag-Ab-E复合物后，标记物失去其特性，如需进行Ag-Ab-E与Ab-E的分离，就可以直接测定游离的Ab-E量，从而推算样品中的Ag量，这种方法称为均相法。通过检测标记酶活性改变，而确定Ag/Ab的含量，用于小分子激素，求半-Ag测定ELISA的基本原理是：（重点）1、抗原或抗体吸附固相载体的表面，并保持其免疫活性；2、抗原或抗体与酶结合形成酶标抗原或抗体，任然保持其免疫活性和酶催化活性，测定时，待测的抗体或抗原和酶标抗原或抗体按一定的步骤与固相抗原或抗体反应；3、加入酶的底物，酶催化底物生成有色产物，有色产物的量与样品中待测抗体或抗原的量呈一定比例，通过定性或定量测定有色产物量，即可确定样品中待测物质含量。ELISA测定常用的方法：（重点）1、双抗体夹心法2、双位点一步发3、间接法4、竞争法5、捕获法6、双抗原夹心法7、中和法双位点一步发（原理）1、单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体；2、采用高亲和力单克隆抗体可提高测定的敏感性和特异性；3、标本中抗原过量时可出现钩状效应优点：不但操作简便、时间缩短，而且敏感性和特异性得到显著提高。钩状效应：即类似于沉淀反应中的抗原过剩的后带现象。待测抗原浓度相当高时，抗原分别与固相抗体、酶标抗体结合，不形成夹心复合物，使结果偏低，严重时可出现假阴性结果。竞争法：（重点）原理：可用于测定抗原，又可用于测定抗体。结合与固相的酶标抗原量与待测抗原的量呈反比结果：参考管或阴性对照管中结合的酶标抗原量最多，颜色最深。捕获法：（重点）用于检测特异性的IgM抗体，在临床主要是用来检测核心抗体的原理和应用ELISA中最常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶(AP)。四甲基联苯胺（TMB）是HRP常用的供氢体TMB经酶作用后由无色变为蓝色，目测对比鲜明，加酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长450nm比例法：一般以A/A0≥2.1（A:样品吸光度值，A0阴性对照吸光度值）表示，但阴性对照吸光度值必须大于0.05，若低于0.05，则以阴性对照吸光度值加0.05为阳性判断标准（此公式只适用与非竞争法）酶免疫组织化学技术（EIHCT）最常用的酶是HRP，供氢体是二氨基联苯胺（DAB）荧光免疫技术荧光的猝灭是指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。藻红蛋白（PE）和异硫氰酸荧光黄（FITC）可以公用488nm激发光荧光免疫显微技术标本的制作：1、要求标本片尽量薄些2、力求标本保持抗原的完整性标本的固定剂：最常用的是丙酮和乙醇制备好的标本片，最好立即进行荧光染色检查，如确需保存，应封装保持干燥，置-20℃一下保存。荧光抗体染色常用的方法：直接染色法和间接染色法直接染色法：原理：是最简单和最基本的染色方法，即将特异性荧光抗体直接加固定的特检抗原标本上，使之与相应抗原结合，以鉴定未知抗原。评价：本法优点是渐变快速、特异性高，但敏感性较差，不能用已知抗原检测未知抗体，而且为检查多种抗原需准备多种特异性荧光抗体。间接染色法：原理：染色分两步,首先是未标记抗体（即第一抗体）与抗原反应，然后是标记的抗球蛋白抗体（即第二抗体）与第一抗体反应。应用：用来鉴定未知抗原或未知抗体本法又称双抗体法，用一种荧光标记的抗球蛋白抗体，能检查多种抗原抗体的复合物评价：其敏感性较高，但方法较繁琐，非特异性干扰因素也相对较多。荧光显