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益生菌制品的质量控制与审批程序中国疾病预防控制中心营养与食品安全所益生菌ProbioticsPRO-BIOTICSmeansForlife益生菌意味着“为了生命”FAO/WHO益生菌的定义益生菌是活的微生物，通过摄入足够数量，对宿主起有益健康的作用。FAO/WHO—Probioticsare:“Livemicroorganismswhichwhenadministeredinadequateamountsconferahealthbenefitonthehost”益生菌－益生菌是活的微生物，通过摄入足够数量，对宿主产生一种或多种特殊且经论证的功能性健康益处。（欧洲食品与饲料菌种协会2002）PROBIOTICS－Probioticsarelivingmicroorganisms,whichwheningestedorlocallyappliedsufficientnumbers,haveoneormorespecifieddemonstratedfunctionalhealthbenefitsforthehost(EFFCA2002)我国有关益生菌的定义：益生菌是指对人和动植物有益的菌。由益生菌生产的产品称为益生菌制品，包括活菌体、死菌体、菌体成分及代谢产物。益生菌的应用食品、功能性食品、膳食补充剂药品、饲料、化妆品益生菌制品作为膳食补充剂（foodsupplements）有粉剂、胶囊或片剂乳酸菌Lacticacidbacteria是指能发酵糖和其它碳水化合物，产生大量乳酸的细菌的通称。美国功能性食品市场每年以15~20%的速度增长,产值达33亿美元。日本保健食品销售额20世纪90年代初达4000亿日元。（Berner&O’Donnell,1998）美国主要的功能食（Berner&O’Donnell,1998）添加植物成分或植物提取物抗氧化、降低心血管疾病的危险、降低癌症发生的危险、降低高血压的危险添加生物活性肽提高免疫系统的功能、提高矿物质的活性等添加膳食纤维预防便秘、降低肠癌发生的危险、降低血中胆固醇添加ω-3多不饱和脂肪酸降低心脏病发作的危险、降低某些癌症发生的危险、提高免疫系统功能等；添加益生菌(probiotics)改善胃肠道功能、提高免疫系统功能、降低肠癌发生的危险添加益生原（prebiotics）改善胃肠道功能、提高免疫系统功能、降低肠癌发生的危险常用的益生菌双歧杆菌（Bifidobacterium）乳杆菌（Lactobacillus）•世界上有70多种含双歧杆菌和乳杆菌的产品，包括酸奶、奶粉和冷冻甜点等。•日本有50多种含有益生菌的不同形式的奶制品•欧洲酸奶对益生菌菌种的基本要求1首先而且最重要的是安全性•必须来自人体或食品•有长期安全使用历史2生产菌种的质量控制3有实验证明具有声称的功能中国的益生菌类保健食品调节肠道菌群增强免疫力从1997年至2004年一共做了28个产品，16个含双歧杆菌、9个含乳杆菌。剂型包括粉剂、胶囊、片剂、口服液。大部分产品声称菌数可达108~1011cfu/g(ml)，经检测菌数可以达到108cfu/g(ml)，液体产品也可达到106cfu/g(ml)。常用的益生菌菌种（Berner&O’Donnel1998）菌种菌株嗜酸乳杆菌LactobacillusacidophilusLa1等保加利亚乳杆菌LactobacillusbulgaricusLb12乳乳杆菌LactobacilluslactisLa1植物乳杆菌Lactobacillusplatarum299v,LpO1鼠李糖乳杆菌LactobacillusrhamnosusGG,GR-1罗伊氏乳杆菌LactobacillusreuteriSD2112干酪乳杆菌LactobacilluscaseiShirota,744类干酪乳杆菌LactobacillusparacaseiCRL431发酵乳杆菌LactobacillusfermentumRC-IRC瑞士乳杆菌LactobacillushelvertiucsBO2菌种菌株青春双歧杆菌-Bifidobacteriumadolescents长双歧杆菌B.longumB536,SBT-2928短双歧杆菌B.breveYakult两双歧杆菌B.bifidusBb-11乳双歧杆菌B.lactisBb-02婴儿双歧杆菌B.infantisShirotaImmunitassB.EssensisDanone,(BioActivia)B.LaterosporusCRL431枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis-双歧杆菌和乳杆菌的安全性问题认为是安全的理由•健康人体的肠道和泌尿-生殖道粘膜中数量相当高•极罕见与疾病有关认为有安全性问题的理由•除干酪乳杆菌（LactobacillusceseiShirota）和嗜酸乳杆菌（L.acidophilusNCFM）有几百年的安全使用历史外，大部分益生菌没有安全使用历史。2001年10月1日-10月4日FAO/WHO专家委员会在阿根廷科尔多瓦就评价食品中含活的益生菌有关健康及营养问题召开会议。会议认为有必要建立评价食品用益生菌的系统方法指南，以确定其健康声称。为建立益生菌的评价指南、推荐指标和方法•成立FAO/WHO联合专家工作组•规定了确定健康声称应提供的资料•目的是制定对益生菌的最低要求•主要指食品用益生菌，排除治疗用生物制剂和基因修饰的生物2002年4月30日-5月1日在加拿大安大略省伦敦市FAO/WHO联合专家工作组起草了《食品中益生菌的评价指南GuidelinesfortheEvaluationofProbioticinFood》1确定益生菌的属/种/株•用表型和基因分型方法进行株的鉴别•益生菌的有益作用有株的特异性•按国际菌种保藏法保存菌株2功能学特征•体外试验胃酸耐受试验、胆汁耐受性、粘膜粘附性和／或人上皮细胞粘附性对条件致病菌的抗菌活性降低致病菌表面粘附能力胆盐水解酶活性•动物试验益生菌的安全性问题全身感染有毒代谢活性易感人群过度的免疫刺激基因转移FAO/WHO专家工作组对益生菌进行安全性评价的建议•抗菌素耐药性类型的测定•某些代谢活性（D-乳酸盐的产生、胆盐非共价键结合）的评价•对人体副作用的评价•售后消费者不良反应的流行病学调查•如待评价的菌株属于已知对哺乳动物有毒性的产毒菌种，必须测定其产毒能力•待评价的菌株属于已知具有溶血性，必须测定其溶血活性我国益生菌产品安全性评价与质量控制益生菌作为一类生物活性制品，必须安全、有效、稳定，益生菌类保健食品的生产加工有其自身的特殊性，如为了使终产品中存在一定数量的益生菌活菌体，产品不能进行消毒灭菌。因此加强其质量管理确保产品质量尤为重要。菌种安全性要求生物学、遗传学、功效学特性明确和稳定。菌种及其代谢产物必须无毒无害。来源及国内外安全食用资料。安全性评价资料（包括毒力试验）。生产菌种的质量控制建立种子库一旦确定某一菌种作为生产用菌种，应建立菌种库以确保为每次生产提供充足的、性状稳定的菌种，以避免或减少菌种的污染及因菌种传代过多而导致遗传变异。一般需要建立三级菌种库，即原代（原始）种子库、主代（主）种子库和生产（工作）种子库。原代种子库—指经研究、筛选、鉴定后确定为食品用益生菌制品生产用菌种，经扩大一代后冷冻干燥一定数量的单支菌种作为种子，2～8℃保存，一般定0代。主代种子库—原代种子经扩大培养得到均匀的，冷冻干燥制成一定数量的单支菌种，作为制备生产种子库的菌种，2～8℃保存。主代种子一般采用1～3代。生产种子库—主代种子经扩大培养得到的均匀培养物，冷冻干燥制成一定数量的单支菌种，2～8℃保存，或悬浮于特定培养液（保护液），分装安培置–70℃以下保存。每生产一批产品用一只菌种，用于生产之前要进行部分项目的检定，合格后方可使用，生产种子一般采用3～5代。《益生菌类保健食品审评规定（试行）》第二条益生菌类保健食品系指能够促进肠内菌群生态平衡，对人体起有益作用的微生态产品。第三条益生菌菌种必须是人体正常菌群的成员，可利用其活菌、死菌及其代谢产物。益生菌类保健食品必须安全可靠，即食用安全，无不良反应；生产用菌种的生物学、遗传学、功效学特性明确和稳定。第四条可用于保健食品的益生菌菌种名单由国家食品药品监督管理局公布。第五条国家食品药品监督管理局对保健食品的益生菌菌种鉴定单位进行认定或认可，菌种鉴定单位的名单由国家食品药品监督管理局公布。益生菌类保健食品的菌种鉴定工作应在国家食品药品监督管理局认定或认可的鉴定单位进行。第六条申请益生菌类保健食品，除按保健食品有关规定提交申报资料外，还应提供以下资料：1、产品配方及配方依据中应包括确定的菌种属名、种名及菌株号。菌种的属名、种名应有对应的拉丁学名。举例：长双歧杆菌Bifidobacterium.longumB5362、菌种的培养条件（培养基、培养温度等）。3、菌种来源及国内外安全食用资料4、国家食品药品监督管理局认定或认可的鉴定机构出具的菌种鉴定报告。5、菌种的安全性评价资料（包括毒力试验）。6、菌种的保藏方法7、对经过驯化、诱变的菌种，应提供驯化、诱变的方法及驯化剂、诱变剂等资料。8、以死菌和／或其代谢产物为主要功能因子的保健食品应提供功能因子或特征成分的名称和检验方法。9、生产企业的技术规范和技术保证。10、企业生产条件符合《保健食品生产良好规范》的证明文件。申请注册的保健食品，使用《可用于保健食品的益生菌菌种名单》之外的益生菌菌种的，还应提供菌种具有功效作用的研究报告、相关文献资料和菌种及其代谢产物不产生任何有毒有害作用的资料。由国家食品药品监督管理局组织相关专业的专家对菌种的食用安全性和功能依据进行评价后，在按保健食品的评审程序进行评审。第七条申请人够买活菌种冻干粉直接生产保健食品，生产加工工艺只是混合、灌装过程，本规定第六条第5项至第10项的资料可由菌种冻干粉原料供应商提供复印件（加盖原料供应商公章）并提供购销凭证。经过长期保藏的菌种，由于种种原因常易发生变异、衰退或死亡。变异是生物基本特性之一，当菌种处在新陈代谢水平最低的生活环境之中，生长繁殖受到外界抑制变为停滞状态，往往更容易发生变异。因此各类菌种在保藏期间必须定期检查，采取措施防止衰退、变异或死亡，发现变异或衰退时能及时恢复。第八条申请注册的用于益生菌类保健食品生产的菌种应满足以下条件：1、保健食品生产用菌种应采用种子批系统。原始种子批应验明其记录、历史、来源和生物学特性。从原始种子批传代、扩增后保存的为主种子批。从主种子传代、扩增后保存的为工作种子批。工作种子批的生物学性状应与原始种子批一致，每批主种子批和工作种子批均应按规程要求保管、检定和使用。在适宜的培养基上主种子传代不超过10代，工作种子传代不超过5代。2、试制单位应有专门的部门和人员管理生产菌种，建立菌种档案资料，内容包括菌种的来源、历史、筛选、检定、保存方法、数量、开启使用、等完整的记录。每年向所在地省级食品药品监督管理部门书面汇报管理情况。3、菌种及其代谢产物必须无毒无害，不得在生产用培养基内加入有毒有害物质和致敏性物质。4、从活菌类益生菌保健食品中应能分离出与报批和标识菌种一致的活菌。第九条试制益生菌类保健食品的场所应具备以下条件：1、建立良好生产规范（GMP），并逐步建立危害分析关键控制典（HACCP）质量保证体系。2、具备中试生产规模，即每日至少可生产500L3的生产能力，并以中试产品报批。3、必须有专门的厂房或车间、有专用的生产设备和设施；必须配备益生菌实验室，菌种必须有专人管理，应由具有中级以上技术职称的细菌专业的技术人员负责；制订相应的详细技术规范和技术保证。第十条生产用菌种及生产工艺不得变更。第十一条不提倡以液态形式生产益生菌类保健食品活菌产品。第十二条活菌类益生菌保健食品在其保质期内活菌数不得少于106cfu/mL(g)。第十三条益生菌类保健食品如需在特殊条件下保存，应在标签和说明书中标示。第十四条所用益生菌菌种在其发酵过程中，除培养基外，不得加入具有功效成分的动植物及其它物质。第十五条经过基因修饰的菌