抗生素效价测定

项目2青霉素效价测定一、知识连接（一）抗生素效价表示方法效价是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度。效价一般指的是生物活性的大小或者高低，生物活性的大小和高低是和效价成正比的。实际应用中，合理使用抗生素的剂量十分重要。抗生素应用时剂量小，因此除重量外，常用特定的效价单位（unit）表示，效价单位也称抗菌活性单位。最初，由于抗生素无法制得纯品，用其生物活性的大小来表示其剂量。一个青霉素的效价单位（U）：能在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株的发育的最小青霉素剂量。一个链霉素效价单位（U）：能在1mL肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌（ATCC9637）发育的最小剂量。重量单位（μg）：以抗生素的有效成分（生理活性成分）的重量作为抗生素的基准单位（大多数使用）。（二）抗生素效价测定抗生素微生物检定法可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。管碟法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm），管内放入标准品和检品的溶液，经16～18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。抑菌圈的大小代表药剂抗菌力的高低。在一定的药剂浓度范围内，药剂的浓度越高则抑菌圈的直径越大。目前最常用的是游标卡尺和直尺直接测量抑菌圈直径。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，即通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。管碟法的基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。然而凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，得出结果慢；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规内。二、制订方案根据情境导入中的问题，制订抗生素生物效价的测定方案表，如表5-2-1所示。表5-2-1抗生素生物效价的测定方案抗生素效价的测定方案任务信息描述任务描述独立完成发酵终点抗生素生物效价的测定设备/工具/耗材发酵罐及附属装置、三角瓶、双碟（或内径9cm的培养皿）、钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm）、钢管放置器、毛细滴管、灭菌刻度吸管、容量瓶、称量瓶、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台等操作步骤1.预试验：确定最佳的试验条件，调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定2.试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、刻度吸管的清洗灭菌；培养基、缓冲液的准备、无菌室的紫外消毒等3.金黄色葡萄球菌菌悬液的制备：将37℃培养16～18h的斜面菌种,用0.85%的生理盐水洗下,离心沉淀(3000rpm×5min),倾去上清液,沉淀菌体再用生理盐水离心洗涤1～2次。再将其稀释至一定浓度(约109个/ml，或用分光光度计在波长650nm测透光率为20%左右即可)4.双碟的制备：在超净工作台上，取已经融化的营养琼脂培养基约20ml注入双碟底层，作为培养基的底层，待培养基凝固后换干燥的陶瓷盖，放置20～30min，备用。取出试验用菌悬液，按预实验的菌量（高浓度所致的抑菌圈直径18～22mm），用灭菌的吸管吸取菌悬液加入已经融化并保温在水浴中（一般细菌48～50℃，芽孢可至60℃）的培养基内，摇匀作为菌层用。取菌层培养基5ml，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上待凝固，用陶瓷盖覆盖，放置20～30min，备用5.供试品、标准品溶液的制备：从冰箱取出的标准品溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，称量前，供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素在称量前1～2小时更换天平内干燥剂。标准品称量不可少于20mg，取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好，以免吸水。称样量的计算：W=V*C/P式中：W：需称取标准品或供试品的重量（mg）V：溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量（mL）C：标准品或供试品高剂量的浓度（U/mL，μg/mL）P：标准品的纯度或供试品的估计效价（U/mg，μg/mg）标准品或供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不少于2ml，稀释步骤一般不超过3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2～3次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。稀释标准品和供试品用的缓冲液应同一批和同瓶（预计不够时，应事先与另一瓶混匀后再用），以免因pH或浓度不同影响预定结果。稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。标准品与供试品高低浓度之比为2：1或4：1，但所选用的浓度必须在剂量反应直线范围内6.放置钢管：用钢管放置器，或其他方法将钢管一致平稳地放入培养基上，钢管放妥后，应使双碟静置5～10min,使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再开始滴加抗生素溶液7.滴加抗生素溶液：每批供试品取5～10个双碟，滴加溶液用毛细滴管或定量加样器，在滴加之前须用滴加液洗2～3次。在双碟的4个钢管中以对角线滴加标准品与供试品溶液的高、低二种浓度的溶液，滴加顺序为SH-TH-SL-TL，也可用SL-TL-TH-SH。（S代表标准品，T代表供试品，H代表高浓度，L代表低浓度），滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩撒时间不同影响测定结果。滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3个，避免受热不均，影响抑菌圈大小8.双碟的培养：将制好的双碟以水平位置平稳移入35～37℃恒温培养箱，培养至所需时间。培养箱中水平叠放的双碟数以不超过三层为宜9.抑菌圈的测量：用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的直径，以毫米为单位，误差不超过0.1mm10.结果与计算：根据实验测量的抑菌圈大小，计算抗生素供试品的效价单位。（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）V=（UH+UL）-（SH+SL）式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出θ：θ=D·log（IV/W）式中：θ：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。（3）求出Pr：Pr=Ar×θ式中：Pr：供试品实际单位数；Ar：供试品标示量或估计单位教师对学生进行分组，每组选出一个小组长，小组长根据小组成员任务分工不同，确定不同任务的责任人。小组成员任务的划分可以参考下面的小组任务分配表，如表5-2-2所示。表5-2-2小组任务分配表小组任务个人职责（任务）小组成员1预试验确定最佳的试验条件，调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，做好记录2试验准备实验室及实验工具的消毒灭菌3金黄色葡萄球菌菌悬液的制备注意菌体浓度4双碟的制备每只双碟加好培养基并凝固好备用5供试品、标准品溶液的制备设计供试品、标准品的称量、溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液6放置钢管使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，在开始滴加抗生素溶液7滴加抗生素溶液保证滴加速度和加量的均匀一致8双碟的培养注意培养温度、时间9抑菌圈的测量确保测量结果准确真实10结果与计算结果计算正确三、实施依据制订方案实施，并填写实验记录表，如表5-2-3所示。表5-2-3实训结果项目表小组任务完成情况完成人员检查人员及情况说明1预试验2试验准备、3金黄色葡萄球菌菌悬液的制备4双碟的制备5供试品、标准品溶液的制备6菌层的制备7滴加抗生素溶液8双碟的培养9抑菌圈的测量10结果的可靠性检验及效价测定四、作业1．通过实训后完善本次任务的实训方案2．抗生素效价测定中，为什么常用管碟法？3．管碟法测定时需要注意哪些问题？来自：发酵生产原理及实训技术，主编韩文清程立坤孙霞，内蒙古大学出版社，出版日期2016.12，ISBN978-7-5665-1112-6定价：55元[e-mail]