凝血四项操作规程

昆仑泌尿外科医院检验科临检室作业指导书文件编号；SZKL-LJ-03版本/修订号；1/0主题内容凝血四项操作规程生效日期：20150101页码；第1页共5页凝血四项操作规程1.目的规范凝血四项（PT、APTT、TT、FIB）的测定。2.实验原理凝固法原理：在确定量的血浆样本经过一定时间的加温后，加入试剂后，采用波长为660nm的光照射样本。凝血过程（纤维蛋白原转化为纤维蛋白）中血的浑浊度可以通过测量散射光光强度的改变来测定。从散射光光强度的测定，可以做出凝血曲线，通过PercentageDetectionMethod法求得血液凝固时间。3.标本要求3.1.标本准备：采用塑料采血管或硅化玻璃注射器静脉采血，针头必须为21号以上，儿童可用23号。采血技术熟练，采血时止血带不可束缚过紧，并且以1分钟完成为宜，最多不宜超过3分钟以免某些凝血因子及纤溶因子活化。3.2.抗凝剂选择：以109mmol/L枸椽酸钠溶液为佳，血与抗凝剂按9：1混合。建议用已加有抗凝剂的硅化真空采血管。也可用带盖塑料管或硅化玻璃管，但应保证血与抗凝剂的比例正确。3.3.收到血标本后应尽快离心分离血浆，并尽快测量，全血储存在4-8℃不应超过2小时，室温下富含血小板血浆可存放3小时，去血小板血浆可存放2小时；4小时内不能测定的血浆应冷藏；不要把血浆置于37℃条件下超过10分钟。应了解不同存放温度和时间对各种凝血因子活性检测的影响。4.材料4.1.试剂的选择一方面要根据所用检测仪器，例如：光电检测法的凝血仪不宜用透光度差的试剂；另一方面要根据实验试剂对疾病的敏感性，例如APTT试剂中所用活化剂不同（可用白陶土、硅藻土和鞣花酸），该试剂对肝素、凝血因子Ⅷ和因子Ⅸ缺乏及狼疮样抗凝物敏感性不同，所以需根据检测项目来选择不同活化剂。(例如常用的APTT试剂的活化剂，以白陶土对凝血因子敏感，硅土对因子及肝素均敏感，鞣花酸对狼疮样抗凝物敏感性较强.PT试剂的选择也一样,例如对口服抗凝药物(华法令)检测应选择ISI与1.0接近的PT试剂。)血栓与止血检验应尽可能选用仪器生产厂家推荐的配套试剂，并选择使用与仪器原理相匹配的试剂。4.2.正常对照血浆：正常对照血浆有商品供应，多为冻干品，也可自制，要求采集20份以上男女各半，年龄在18-25岁之间的健康个体，删除服药者，须在平静状态下采血，血液经抗凝离心后分离血浆。取等量的各份个体血浆进行混匀，然后分装小瓶，冻存于-80℃或冷冻干燥备用。4.3.参比血浆或称标准血浆（质控血浆）：为了使检测结果在同一实验室的不同时期或不实验室间具有可比性，就要使用标准品。5.仪器与试剂5.1仪器：深圳锦瑞CA-54半自动化血凝分析仪。5.2试剂：上海太阳生物技术有限公司。5.3仪器安装后应对其主要性能参数进行评价，内容包括精密度、线性范围、可比性、抗干扰试验试验等。评价结果应在仪器说明书标示范围之内。昆仑泌尿外科医院检验科临检室作业指导书文件编号；SZKL-LJ-03版本/修订号；1/0主题内容凝血四项操作规程生效日期：20150101页码；第2页共5页5.4仪器在测定常规标本前应使用配套的校正物建立标准曲线，在更换新批号的试剂或仪器维修后，要重新建立标准曲线。无校正物的测定项目，可伤使用配套的定值质控物进行测定，测定结果应在定值质控物标示的允许范围内。5.5每台仪器上使用的凝血活酶试剂应有特定的ISI（国际敏感指数）值，这样才能使患者INR（国际标准化凝血酶原时间）比值的结果有可比性。自动终点测定目前得到广泛应用，仪器有半自动和全自动两种类型。仪器应用的检测系统有化学的、机械的或电子等，形成凝块所需时间也有差异。对每种方法都应建立自己正常参考范围，一些光学系统进行测定的仪器对血脂高、溶血、黄疸血浆不易得出精确的检测结果。6.操作步骤6.1PT检测步骤6.1.1打开电源开关，仪器自检后进入主菜单页面，然后按“1”进入“测量标本”子菜单。6.1.2设置测试项目和病人编号：按”1“键设置测试项目，按“←”“→”选择“PT”，确认请按“确认/ENTER”键，取消请按“菜单/MENU”键。按“2”键设置病人编号，直接输入病人号后，确认请按“确认/ENTER”键，取消请按“菜单/MENU”键。6.1.3将PT应用试剂根据测试样本多少取适量于试剂预温位预热至37C6.1.4加血浆20ul于空比色杯内（样本应加入杯子底部，不能有气泡），置于测试通道或预温位预温2分钟。6.1.5当预温到时后，将已预温的比色杯放入测试通道内，按“通道1”键，屏幕提示“请加入试剂”时，用联机加样枪吸取40ulPT工作试剂加入比色杯中，当加样器按到底后松开时仪器自动开始计时检测，最后显示和打印测量结果。6.1.6质控品、正常对照血浆：操作方法同样品。6.1.7关机：按“菜单/MENU”键，退回到主菜单后即可关机。6.2APTT检测步骤6.2.1打开电源开关，仪器自检后进入主菜单页面，然后按“1”进入“测量标本”子菜单。6.2.2设置测试项目和病人编号：方法同6.1.26.2.3加血浆20ul于空比色杯内，再取APTT试剂20ul加入比色杯内，混匀后，置于测试通道或预温位预温3分钟。6.1.4当预温到时后，将已预温的比色杯放入测试通道内，按“通道3”键，屏幕提示“请加入试剂”时，用联机加样枪吸取20ulCaCl2（CaCl2预温3分钟）加入比色杯中，当加样器按到底后松开时仪器自动开始计时检测，最后显示和打印测量结果。6.1.5质控品、正常对照血浆：操作方法同样品。6.1.6关机：按“菜单/MENU”键，退回到主菜单后即可关机。6.3TT检测步骤6.3.1打开电源开关，仪器自检后进入主菜单页面，然后按“1”进入“测量标本”子菜单。昆仑泌尿外科医院检验科临检室作业指导书文件编号；SZKL-LJ-03版本/修订号；1/0主题内容凝血四项操作规程生效日期：20150101页码；第3页共5页6.3.2设置测试项目和病人编号：方法同6.1.26.3.3加血浆30ul于空比色杯内，置于测试通道或预温位预温2分钟。6.1.4当预温到时后，将已预温的比色杯放入测试通道内，按“通道4”键，屏幕提示“请加入试剂”时，用联机加样枪吸取30ul已预温好的TT试剂加入比色杯中，当加样器按到底后松开时仪器自动开始计时检测，最后显示和打印测量结果。6.1.5质控品：操作方法同样品。6.1.6关机：按“菜单/MENU”键，退回到主菜单后即可关机。6.3FIB检测步骤6.3.1打开电源开关，仪器自检后进入主菜单页面，然后按“1”进入“测量标本”子菜单。6.3.2设置测试项目和病人编号：方法同6.1.26.3.3加血浆40ul于空比色杯内，置于测试通道或预温位预温3分钟。6.1.4当预温到时后，将已预温的比色杯放入测试通道内，按“通道2”键，屏幕提示“请加入试剂”时，用联机加样枪吸取20ul已预温好的FIB试剂加入比色杯中，当加样器按到底后松开时仪器自动开始计时检测，最后显示和打印测量结果。6.1.5质控品：操作方法同样品。6.1.6关机：按“菜单/MENU”键，退回到主菜单后即可关机。7.质量控制7.1质控品跟随常规标本一起测定，意即质控品必须与患者标本在同样条件下进行检测，建立质控图信息后，以判断结果是否在控。7.2为了使检测结果在同一实验室的不同时期具有可比性，必须使用标准品或参比血浆进行室内质量控制。8.参考区间PT：10-14秒。待检者的测定值较正常对照延长3秒以上有临床意义。APTT：22-38秒。待检者的测定值较正常对照延长10秒以上有临床意义。TT：10-16秒FIB：200-400mg/dl9.注意事项9.1血栓与止血实验的质量控制和标准化是实验结果可靠性、可比性的基本保证。其实验项目繁多，现阶段大部分是应用形成可见的纤维蛋白丝为终点。这种方法所采用的均为生物性材料，其凝血活性或抗凝、纤溶活性可随时间、温度、生理变化、个体差异而变化，故其质量控制更为重要。9.2要重视检测前的质量控制，包括合理的标本采集和处理；试剂的选择；器材、仪器、质控品、正常对照品的质量保证。9.3实验操作时应警惕许多实验误差来源于技术错误。在实验技术、试剂、温度及PH值上微小的变化都有导致试验结果明显的变化。例如，在一期法PT测定时孵育时间和温度应严格控制。血浆绝不能在37℃放置超过10分钟；凝血活酶放置时间也不能超过说明书所规定的期限。昆仑泌尿外科医院检验科临检室作业指导书文件编号；SZKL-LJ-03版本/修订号；1/0主题内容凝血四项操作规程生效日期：20150101页码；第4页共5页血浆凝固主要是酶催化的反应。PH环境和溶液离子强度在实验过程中要严格控制，反应混合物PH必须处于7.2-7.4之间.每次APTT实验时,活化部分凝血活酶试剂和血浆混合物的孵育时间决定了APTT试验中接触活化的量,所以其混合的时间和技术对检测结果影响很大.9.4实验前应检查血浆是否有溶血、黄疸、脂血和出现凝块。红细胞膜含有磷脂，溶血标本具有与血小板第3因子（磷脂）相似的凝血活性，能缩短溶血血浆的APTT值。9.5标本中如出现凝块，无论多小的凝块均会影响实验结果。9.6APTT、TP需去血小板血浆，一般3000r/min离心10min后分离血浆。10.临床意义：10.1PT检测的临床意义10.1.1PT延长a.外源凝血系统的因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和纤维蛋白原减低，如先天性某因子缺乏症和低（无）纤维蛋白原血症，但均很少见，获得性的见于DIC、原发性纤溶、维生素K缺乏症、肝脏疾病等。b.血循环中抗凝物质增加，如肝素或FDP增多等。10.1.2PT缩短口服避孕药、高凝状态和血栓性疾病等。10.1.3用于香豆素类等口服抗凝剂的监控10.1.3.1一般认为以维持PT值在参考值的2倍左右（1.3—2.5倍）即25—30s，或PTR为1.3—1.5（最大不超过2）为宜。10.1.3.2PT%应控制在40%以上，减低到40%有出血倾向。10.1.3.3不同情况下口服抗凝药治疗的最佳抗凝强度时INR的范围：a.术前两周或术中口服抗凝药，INR为1.5—3.0；b.原发或继发静脉血栓的预防，INR为2—3；c.活动性静脉血栓、肺梗塞、复发性静脉血栓的预防，INR为2—4；d.动脉血栓栓塞的预防，心脏换瓣术后，INR为3—4.5。10.2APTT检测的临床意义10.2.1.受检者的测定值较正常对照延长超过10s以上才有病理意义。10.2.2对内源凝血途径因子（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ）缺乏较CT敏感（血小板异常不影响APTT）能检出Ⅷ：C小于25%的轻型血友病。对凝血酶原、纤维蛋白原缺乏则不够敏感，故APTT延长的最常见疾病为血友病。此时可进一步做纠正试验，即于患者血浆中加入1/4量的正常新鲜血浆、硫酸钡吸附血浆或正常血清（试剂参见凝血酶原消耗试验的纠正试验），再做APTT，如正常血浆和吸附血浆能纠正延长的结果而血清不能纠正，则为因子Ⅷ缺乏；如吸附血浆不能纠正，其余两者都能纠正，则为因子Ⅸ缺乏；如三者都不能纠正，则为病理性循环抗凝物质。10.2.3在使用肝素治疗时，多用APTT监测药物用量，一般以维持结果为基础值的2倍左右（1.5—3.0倍）为宜（75—100s之间）。但应事先检测所用部分凝血活酶试剂是否对肝素敏感，即向正常人血浆中加入不同量肝素（从每毫升0.1—1.0IU），看其APTT是否相应延长。10.3TT检测的临床意义10.3.1TT延长：患者血循环中AT-Ⅲ活性明显增高，肝素增多或类肝素抗凝物质存在，如SLE、肝病肾病等，异常纤维蛋白原血症，低（无）纤维蛋白原血症，昆仑泌尿外科医院检验科临检室作业指导书文件编号；SZKL-LJ-03版本/修订号；1/0主题内容凝血四项室内质控的标准操作程序生效日期：20150101页码；第5页共5页FDP增多（如DIC），异常球蛋白增多（如MM）等。10.3.2TT缩短：常见于血样本有微小凝块或钙离子存在时。10.4FIB检测的临床意义10.4.1FIB减少见于：先天性低（无）纤维蛋白原血症、严重肝脏疾病、原发性纤维蛋白溶解、DIC、