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动物细胞工程2.2动物细胞工程常用技术手段动物细胞工程动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。动物细胞工程常用的技术手段技术：从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。2、为什么要培养动物细胞？一、动物细胞培养1、动物细胞培养的概念许多动物细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。但是单个细胞分泌的蛋白质量是很少的，需要借助于大规模的动物细胞培养来实现。动物细胞培养技术动物细胞培养技术2003年西安第四军医大学专家研制成功的活体“人造皮肤”已经正式进入临床应用1、选什么样的组织进行培养？2、为什么把组织要剪碎，用什么处理得单个细胞？3、培养基的种类？4、细胞培养（生长）有什么特点？5、什么是原代培养，传代培养？6、细胞可以无限培养吗？3.动物细胞培养的过程3.动物细胞培养的过程动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液10代细胞部分细胞“癌变”，遗传物质改变，无限传代动物细胞培养不能最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞株细胞细胞系3.动物细胞培养的过程细胞悬浮液细胞贴满瓶壁50代细胞原代培养传代培养⑴原代培养:将动物组织消化后的初次培养。⑵传代培养:对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。⑴为什么用胚胎组织或幼龄动物的组织细胞进行细胞培养?细胞分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。⑵为什么要将组织分散成了单个细胞再进行培养？①分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞容易获得营养物质，其代谢废物容易排出；②分散成单个细胞培养，容易完成细胞水平的工程技术操作。⑶为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来？当贴壁细胞生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖—细胞出现接触抑制。⑷哪些细胞失去了接触抑制？传代培养时，少数超过50代的细胞，由于遗传物质发生改变，可无限增殖，并失去了接触抑制——肿瘤细胞。4、体外培养动物细胞需要物质和环境条件⑴无菌、无毒的环境①对培养液、培养用具进行无菌处理；②在培养液中加抗生素；③定期更换培养液。⑵充足的营养葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血浆或血清.⑶温度和PH36.5±0.5℃；PH=7.2―7.4⑷气体环境——O2和CO2C02的主要作用是维持培养液的PH。含95%空气加5%CO2混合气体5.动物细胞培养应用：①.大规模生产生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等；②.检测有毒物质，判断某种物质的毒性；（检测致癌率、致畸率）③.培养基因工程中的受体细胞④、生理、病理、药理的研究应用。获得细胞或细胞产物细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物组织和动物细胞培养的比较1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是----（）A．细胞系B．细胞株C．原代细胞D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是--（）A.动物细胞融合B.单克隆抗体C.胚胎移植D.动物细胞培养AD课堂反馈练习3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）A.容易产生各种变异B、具有更强的全能性C.取材十分方便D、分裂增殖的能力强D4、下列属于动物细胞工程中的工具是（）A．限制性内切酶B．DNA连接酶C．胰蛋白酶D．果胶酶C二.动物细胞核移植技术和克隆动物将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）。1.动物细胞核移植概念：分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易；细胞分化程度高，恢复全能性不容易（难度高）1996年7月5日，英国科学家伊恩·维尔穆特博士成功获得体细胞克隆羊“多莉”，这是世界上第一例利用成年体细胞核获得的克隆动物.2.体细胞核移植的过程：277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫（代孕母体）胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程重组细胞多莉羊诞生的意义：多莉羊在技术上的突破之处在于供核细胞不是胚胎细胞，而是已分化的体细胞。这说明已经分化的动物体细胞核，仍然具有全能性，在合适的条件下，就可以发育成新的个体。克隆技术在繁育优良家畜、治疗人类遗传病、抢救濒危物种和保护生物多样性等方面有广阔的应用前景。⑴核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？⑵通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？MⅡ中期的卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。⑶在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为了使核移植的胚胎或动物的遗传物质绝大部分部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。⑷为什么用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞？培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，而且细胞分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。⑸你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。3.体细胞核移植技术的应用前景：1.加速家畜遗传改良的进程2.保护濒危物种3.生产医用蛋白质及组织器官的移植4.了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病3、体细胞核移植技术存在的问题（1）成功率非常低（2）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。(4)对克隆动物的食品安全存在争议。7、动物细胞培养的正确过程是（）A.原代培养→传代培养→细胞株→细胞系B.原代培养→传代培养→细胞系→细胞株C.传代培养→细胞系→原代培养→细胞株D.原代培养→细胞系→传代培养→细胞株8、下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（）A．培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清B．原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长停滞C．动物细胞培养一般能够传到40～50代，但其遗传物质发生了改变D．动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健康细胞AC10、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此图回答(1)容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自___________。(2)容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是__________，然后用酶处理，这是为了使细胞分散开来。这样做的目的是_______________.(3)培养首先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有__________等。在此瓶中培养一段时间后，一般传到第代，有许多细胞衰老死亡，到这时的培养称为___________.(4)为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用_____处理，然后配置成___________，再分装。(5)在C瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是_________________________。幼龄动物的器官或组织、动物胚胎剪碎胰蛋白使每个细胞能与培养液接触葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清10原代培养胰蛋白酶细胞悬浮液细胞没有发生瘤变⑴.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成，必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等以及多种生长因子，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。⑵.幼龄与老龄的组织细胞相比较，分化程度低的与分化程度高的细胞比较，哪一种更易于培养？为什么？细胞的衰老与动物机体的衰老有密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更易于培养⑶.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。⑷.如何将动物组织分散成单个的细胞呢？⑸.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间隙中含有是什么物质成份？剪碎组织，再用胰蛋白酶处理。胰蛋白酶可分解蛋白质。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。⑹.细胞贴壁生长对培养容器有何要求？培养皿或培养瓶的内表面要光滑、无毒、易于贴附。动物细胞培养过程胚胎或幼龄动物的组织器官（细胞来源）细胞悬浮液贴满瓶壁的细胞无限细胞系剪碎胰蛋白酶分离细胞原代培养传代培养胰蛋白酶分瓶培继续养（遗传物质发生改变）40—50代细胞