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引物设计心研所2008-7-17生物秀-专心做生物或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（PrimerDesign），酶切分析窗口（RestrictionSites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能。生物秀-专心做生物这是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。生物秀-专心做生物在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。生物秀-专心做生物能即时分析引物二级结构。在左下的两排按钮可以显示发现了何种二级结构，也显示二级结构的自由能数值G单位kcal/mol。生物秀-专心做生物引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列。可以使用CTRL-XCTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列,并从剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法。进行粘贴时Paste粘贴窗口会激活，用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式，也可以手工键入引物序列。一旦引物被编辑发点击Analyze按钮即可分析编辑后的引物。生物秀-专心做生物个碱基,等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建libraryprotocol,28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作用。长PCR引物能给扩增带来更好的特异性,长引物也允许通过降低退火温度来能提高反应的灵敏度,不过长引物通常更易于形成包括发卡结构二聚体自身互补等二级结构。v理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡。生物秀-专心做生物融链温度：PRIMERPREMIER根据相邻二碱基对作用理论nearestneighbortheory来计算融链温度。PCR反应的合适Tm范围为56到63°C。vGC%GC含量：对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。vDegeneracy多义性：当设计多义引物时应尽量减少引物多义性这样会带来更好的特异性应尽量避免3末端的多义性因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。v3’EndStability3末端稳定性：引物稳定性影响它的错配效率。一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5末端和相对稳定性较弱的3末端，如果引物3稳定性强有可能在即使5末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩secondarybands。而3末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时由于3末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。生物秀-专心做生物钳：引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5末端，这一段有较强稳定性的5末端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。生物秀-专心做生物二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量。发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率。形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。生物秀-专心做生物发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成,引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对.发卡结构的稳定性可以用自由能衡量,自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量,如果自由能值大于0则该结构不稳定,从而不会干扰反应.如果自由能值小于0则该结构可以干扰反应。按下按钮All可以显示其具体结构。生物秀-专心做生物引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增，产物二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果配对区域在3末端问题会更为严重，3末端配对很容易引起引物二聚体扩增使用DimerReport功能可以预测二聚体的形成。v引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，二聚体和发夹结构形成的能值越高越稳定，越不符合要求。生物秀-专心做生物如果引物可以结合除目的位点外的其他区域扩增效率将明显降低，目的产物带将减少或出现涂布（smear），PRIMERPREMIER会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成局部的错配，3末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对。可以分别设定确认为错配的3末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。生物秀-专心做生物匹配度低的引物对常常不太有效，是因为在同样退火温度下，Tm低的引物决定扩增的特异性，而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始。PRIMERPREMIER会计算每一对引物的匹配度100分为满分并按照分数按降序排列计。生物秀-专心做生物=100-(△G(Dimer)1.7+△G(Hairpin))1.4+△G(FalsePriming)1.5)FormulaforDeterminingPrimerPairRatingRating=Averageofsenseandanti-senseprimerrating-((Tmdifferencebetweenprimers)*1.7)-(DGCrossDimer)*1.3))生物秀-专心做生物的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图。vOligo6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。生物秀-专心做生物进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。生物秀-专心做生物或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口生物秀-专心做生物出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq生物秀-专心做生物点击“window”再点击“Tile”生物秀-专心做生物∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。vTm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。vFrq曲线为“Oligo6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。生物秀-专心做生物窗口，＃代表引物对的编号，依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量生物秀-专心做生物点击任一行出现“PCR”窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息。生物秀-专心做生物关掉“PCR窗口”和“primerPairs窗口”回到原来的窗口，就能看到引物的序列和位置，图中手型鼠标所指即为引物序列。生物秀-专心做生物至此引物设计已经完成，你可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等。生物秀-专心做生物至此引物设计已经完成，你可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等。生物秀-专心做生物当上下游引物全选好以后，首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（crossdimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。生物秀-专心做生物进入网页：生物秀-专心做生物栏中输入引物序列：注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’简便的做法是同时输入上下游引物。输入上下游引物系列都从5’—3’。输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物，如下图：生物秀-专心做生物栏中：Database根据预操作基因的种属定了，本引物可选Humangenomic+transcript或Others(nretc.)。生物秀-专心做生物中：选择Somewhatsimilarsequences(blastn)项，如下图：生物秀-专心做生物参数设置，进入参数设置界面。生物秀-专心做生物中：Expectthresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框将数字改为7。如下图：生物秀-专心做生物图中①代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分图中②代表这些序列与引物匹配的得分值位于40～50分图中③代表这些序列与引物匹配的得分值位于50-80分，图中