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炫酷的蓝白斑筛选生工二班李全威简述原理注意事项Contents背景蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法细菌的乳糖操纵子（lac）包含一个叫lacZ的基因，它编码的蛋白是β-半乳糖苷酶。乳糖操纵子可以被乳糖或者乳糖类似物IPTG给激活，启动下游基因的表达。（严格的来说，IPTG是与lac阻遏物结合，让它失活来启动lac的表达的）。β-半乳糖苷酶可以降解一种连接有染料的底物（X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成半乳糖和一种不溶于水的蓝色色素。背景科学家发现，lacZ基因删掉一段（删掉后的突变体命名为lacZΔM15）后编码的突变体β-半乳糖苷酶是没有功能的，当被删掉的一段（命名为α-肽）与lacZΔM15同时在一个细胞内表达的时候，他们可以组合重新恢复功能。这个过程叫α-互补。根据这个特性，科学家在α-肽的氨基酸加了一个多克隆位点（MCS），如图中的黄色楔形。将改造过的α-肽DNA编码片段插入到质粒中，构建载体。当目的基因插入到多克隆位点中，α-肽就变成图A细胞所示，不能与细胞的β-半乳糖苷酶突变体结合恢复功能。而如果没有基因插入多克隆位点，也就是空载情况下，α-肽能与细胞中的β-半乳糖苷酶突变体互补而恢复功能（如细胞B所示）。原理实验操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片断）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。原理对照：用空载体转化平板，板子上的所有克隆应该都是蓝色。证明IPTG和X-gal都没有问题。培养时间：一般平板要在培养箱中至少培养16-20小时才可以让细菌表达出β-半乳糖苷酶，从而菌落才能变色。如果平板上的所有克隆子都是白色，这往往是不正常的。将平板放冰箱冷藏：平台在培养箱过夜培养后放在冰箱中冷藏一会，利于不溶的色素沉淀，从而可以更好的与蓝色菌落区分开。制作平板的时候要注意：X-gal对光和温度非常敏感，需要在培养基灭菌后再加入。注意事项假阳性：蓝白斑筛选只能证明有DNA插入到MCS，而不能证明插入的就是你的目的DNA片段。假阴性：这种情况比较罕见，如果插入的片段较小，同时造成通读，而且能与细胞中突变的β-半乳糖苷酶互补。宿主细胞：宿主细胞得是lacZΔM15基因型的，如XL1-Blue,DH5α,DH10B,JM109,STBL4,JM110,和Top10质粒载体：需要含有α-互补克隆的MCS，如pGEM-T,pUC18andpUC19和pBluescript。