己糖激酶(hexokinase,HK)试剂盒使用说明

己糖激酶(hexokinase，HK)试剂盒使用说明微量法货号：BC0745规格：100管/96样产品内容：提取液：100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；测定意义HK（EC2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。操作步骤：一样本的前处理1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。3、血清（浆）样品：直接检测。二测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。2、样本测定（1）在试剂二中加入18mL试剂一充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂4℃保存一周；（2）在试剂三中加入1mL试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周；（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三和180μL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。注意：不同匀浆组织中HK活力不一样，做正式试验之前请做1-2只预试，若ΔA0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至2min,使ΔA0.5，以提高检测灵敏度。HK活性计算a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清（浆）HK活性单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=643×ΔA、组织、细菌或细胞中HK活性（1）按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/mgprot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr（2）按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W（3）按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/104cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.286×ΔAV反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。b.用96孔板测定的计算公式如下1、血清（浆）HK活性单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=1286×ΔA2、组织、细菌或细胞中HK活性（1）按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/mgprot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr（2）按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=1286×ΔA÷W（3）按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/104cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.572×ΔAV反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。