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事先说明：该教程是本人通过网络上各种资料、信息等，加上自身使用之后，总结出来的简单教程，可能有部分文字重复，请原作者见谅！此教程针对于第一次使用PrimerPremier5设计引物的童鞋，高手可以不用看了，同时附上图片（图片均为原创），使大家更易学习，若有不对的地方，请指正，谢谢！结尾部分提到的Oligo7软件是另一款强大的引物设计分析软件，在这里暂时不做介绍。——张小柯引物设计步骤1、搜索目的基因的CDS在NCBI（）上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置并做记录备用，点击FASTA链接，复制编码序列，保存至文本文件备用。2、用PrimerPremier5设计引物（1）打开PrimerPremier5，点击File→New→DNAsequence，出现输入序列窗口，打开之前保存的文本文件，复制编码序列，粘贴至输入框内，选择AsIs并点击OK，其他默认即可，点击Primer，进入引物设计窗口（如图1）。图1引物设计窗口（2）此窗口可以链接到“引物搜索”、“搜索结果”以及“引物编辑”选项，下面显示两条引物的信息概况，包括“Rating”（评分）、“SeqNo”（序列编号）、“Length”（引物长度）、“Tm”（DNA分子的熔点）、“GC%”（GC含量）等项目。最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，“Hairpin”（发卡）、“Dimer”（二聚体）、“FalsePriming”（错误引发位置）和“CrossDimer”（引物间交叉二聚体）。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为宜。（3）点击Search按钮，进入引物搜索参数设定窗口（如图2），“SearchFor”项选择“PCRprimers”，“SearchType”项选择“Pairs”，“SearchRanges”项里设定两条引物的搜索区域和PCR产物长度，“PrimerLength”项里设定引物长度。“SearchMode”项选择“Manual”（手动），并点击“SearchParameters”按钮，进入ManulSearchParameters窗口，进行详细参数设置。图2引物搜索参数设定窗口（4）在ManulSearchParameters详细参数设定窗口中（如图3），SearchStringency项一般选择High，但要注意下面参数中的Tm值范围和GC含量范围，Tm应该在55～70度之间，GC含量范围应该在45%～55%间，其他默认即可。图3详细参数设定窗口（5）点击OK回到SearchCriteria窗口，再点击OK开始搜索引物，搜索完成后会有两种情况（如图4），一种是找到合适的引物，另一种则没有找到合适的引物，若没有找到合适的引物，按Cancel返回，适当放宽引物搜索条件，直至找到合适的引物为止。点击OK，进入引物搜索结果窗口。图4引物搜索完成后两种不同的情况（6）在引物搜索结果窗口（如图5）中，搜索结果默认按照“Rating”（评分）排序，点击其中一个搜索结果，可以在“引物设计窗口”（图1）中显示该引物的综合情况。图X引物搜索结果窗口（7）在引物设计窗口中，可以点击左上角的“S”和“A”按钮，分别查看上游引物与下游引物，并可点击“EditPrimers”按钮，在弹出的“引物编辑窗口”（如图6）中对引物进行人工编辑。第一行不可编辑区为酶切位点指示区，第二行可编辑区域为蛋白质编辑区，第三行可编辑区域为核酸编辑区，一般在第三行进行编辑，编辑好后，点击“Analyze”按钮进行分析，可分析出新引物的信息及是否存在二级结构等，编辑好后点击OK返回。图6引物编辑窗口（8）从理论上讲，两条引物都不存在二级结构最好（如图7），同时引物的GC含量应在45%～55%之间，Tm应该在55～70℃之间，且Tm相差应在2℃以内，还要注意的一点是，两条引物的3’端不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。图7理想中引物的信息概况（9）将上下游引物的信息保存下来备用，此外，可利用Oligo7软件对于引物作出更具体更详细的评价，虽然Oligo7自身带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如PrimerPremier5，但其强大的分析功能可供我们参考。