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生物技术制药第一章现代生物技术一、现代生物技术的定义与主要内容生物技术(BiotechnologyorBioengineering）:对生物有机体（微生物至高等动、植物）或其组成部分（器官、组织、细胞或细胞器等），运用分子生物学、细胞生物学、生物化学、生物物理学、生物信息学等手段，研究、设计、改造，以改良生物乃至创造新的生物品种的一种技术体系。现代生物技术包括四个方面：（1）基因工程：生物遗传物质——核酸的分离、提取、体外剪切、拼接重组以及扩增与表达等技术。（2）细胞工程：细胞（也包括器官或组织）的离体培养、繁殖、再生、融合及细胞核、细胞质及染色体与细胞器（如线粒体、叶绿体等）的移植与改建等操作技术。（3）酶工程：利用酶，借助固定化、生物反应器和生物传感器等新技术、新装置，高效优质地生产特定产品的技术。（4）发酵工程（微生物工程）：给微生物提供最适宜的发酵条件以生产特定产品的技术。生物技术的依据和出发点：生物有机体的种种机能，是生物在生长、发育与繁殖过程中进行物质合成、降解和转化的能力（即利用其新陈代谢的能力），反应器、代谢反应、酶、特定的遗传基因核心基础：基因工程和细胞工程“工程菌株”或“工程细胞株”使酶工程或发酵工程生产出更多、更好的产品，发挥出更大的经济效益。酶工程和发酵工程现代生物技术产业化，特别是发展大规模生产的最关键环节。二、现代生物技术的优越性（一）不可取代性植物品种改良杂交育种基因工程改良品种基因资源的来源可不受限制牛(猪)生长激素基因鱼生长、发育快，体重速增人血红蛋白基因猪体内生产人的血红蛋白，分离，可作为人血液的替代物。生长激素释放抑制因子（抑制生长激素不合时宜的分泌，“肢端肥大症”的特效药）50万个羊脑5mg样品，化学法300多美元/5mg基因工程7.5升大肠杆菌发酵5mg,成本几十美分。（二）快速、精确试剂盒有效的早期诊断（遗传病、病毒引起的疾病和癌症等）。McAb检查妇女妊娠比用抗血清法检查提高了灵敏度，怀孕后8天得知，准确率100％（三）低耗、高效“酶”催化化学效应，无需高温、高压和强酸碱等→大大降低能耗的成本、能耗。例：L-苹果酸生产（生物技术）产氨短杆菌→收集菌体→固定化细胞→→L-苹果酸原理：延胡索酸→L-苹果酸成本比化学合成降低几十倍。人生长激素（治疗侏儒病）一个患者每年需用量50个死人的垂体中提取基因工程生产价格为1／4提取，不需依赖死人脑。（四）副产物少、不良反应小、安全性好疫苗的生产常规方法用血液，成本高，可带来病毒感染的危险性。现代生物技术用大肠杆菌如乙肝疫苗，凝血因子等→大大改进使用的安全性。2.“生物导弹”McAb接抗癌药物→体内McAb只与该肿瘤细胞特异性结合→抗癌药物专一、靶向到肿瘤细胞小鼠的免疫球蛋白McAb免疫球蛋白分子中含有人免疫球蛋白分子片段三、现代生物技术在医药领域的应用（—）在疾病诊断与治疗中的应用1.单克隆抗体与疾病诊断妊娠试验FDA批准上市的McAb产品已有几十种。3.基因诊断核酸分子杂交技术80年代中期聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）体外扩增基因的方法产前和症状前基因诊断:苯丙酮尿症、珠蛋白合成障碍性贫血、假肥大型肌营养不良、甲型血友病、乙型血友病、成年型多囊肾、慢性进行性舞蹈病等遗传病4.基因治疗因单一结构基因即编码蛋白质的基因缺陷所引起的遗传病。治疗:导入正常基因→校正缺陷基因引起的DNA代谢异常及细胞突变→使之恢复正常功能。（二）未来医药卫生领域中的生物技术展望1.转基因动物生产的“转基因药物”1978年把人tPA基因转入小鼠受精卵发育成转基因小鼠并证明在其乳汁中能得到tPA美国DNx公司的“制药工厂”转基因猪环球基因药物公司转基因奶牛基因酶公司转基因山羊英国药物蛋白公司转基因绵羊“转基因药物”与基因工程药物相比,产量高，成本低,具有与人体自身产生的蛋白相同的生物学活性。乳腺细胞能进行一系列的翻译后修饰作用，包括糖基化作用等，正确地产生人体蛋白。2.人型McAb(monoclonalantibody)的制备技术路线：鼠型McAb分子中更换一段人抗体分子中与抗原结合的链段（用蛋白质工程的方法）；从人鼠杂交瘤细胞中直接克隆人抗体基因，并使之在细菌中得到表达；将人免疫球蛋白重链C区基因转入小鼠受精卵，发育成转基因小鼠，用特定抗原免疫→得人型化McAb。3.基因治疗“基因打靶”技术将外源基因定点整合到细胞基因组的某一确定位点上，因而能对缺陷基因进行原位修复。聚合酶链反应及其他不断涌现的分子生物学新技术将得到广泛应用。在细菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等不同的细胞内能得到高效表达的载体将不断地构建成功，大幅提高基因工程的生产效率。生物技术后处理工程和蛋白质工程将迅速发展有目的地修饰、改造乃至重新组建4.生物技术的各个环节第一节生物药物(biopharmaceutics)一、概念利用生物体及其成分综合利用生物学、生物化学、微生物学、生物组织免疫学、物理化学、药学原理、方法加工制造的预防诊断疾病的制品治疗第二章生物药物与生物技术药物概述（一）按来源和制造方法1.动物来源动物脏器资源丰富家畜：猪、马、牛、羊家禽：鸡、鸭海洋生物：海带、鲨鱼、海蛇二、分类2.微生物来源发酵法优点：1）微生物及其代谢物资源丰富、开发潜力大2）培养、繁殖快、产量高、成本低，便于大规模工业生产，不受原料、运输、保存、季节和资源供应影响3）生产的生物药物可综合利用代谢物和菌丝体;诱变选育良种;加入前体培养法4）体内酶的转化作用，使复杂、难反应能专一、迅速4.化学合成氨基酸、多肽、核酸降解物及其衍生物、维生素、激素结构改造以高效，长效和高专一性3.植物来源植物中的蛋白质、多糖、脂类、核酸等生物大分子的研究和利用5.现代生物技术产品基因工程技术生产的重组活性多肽活性蛋白质类基因工程疫苗McAb多种细胞生长因子利用转基因动、植物生产的生物药物利用蛋白质工程技术改造天然蛋白质创造自然界没有的而功能上更优良的蛋白质类生物药物生物技术药物（基因工程药物，BiotechDrugs）:以DNA重组技术（包括基因工程技术、蛋白质工程技术）生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。1.细胞因子干扰素类：IFN-、IFN-β和IFN-。IFN-有lb，2a，2b等2.细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子类：IL-2和突变型白介素-2；TNF-和TNF受体。二、生物技术药物的主要类型第二节生物技术药物一、概念3.造血系统生长因子类：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO)、干细胞生长因子（SCF）等。4.生长因子类：促进细胞生长、组织再生和创伤治疗。胰岛素样生长因子（ICF）、表皮生长因子（ECF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF-与TGF-β）、神经生长因子（NGF）及各种神经营养因子。5.重组蛋白质与多肽类激素：人重组胰岛素（Humulin）、人生长激素（rhGH）、促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、绒毛膜促性腺激素（HCG）等。6.心血管病治疗剂与酶制剂：心血管疾病和抗肿瘤治疗Ⅶ因子、水蛭素、组织纤溶酶原激活剂（tPA）、尿激酶、链激酶、葡激酶、门冬酰胺酶、超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖脑苷酶及DNase等。7.重组疫苗与单抗制品：重组乙肝表面抗原疫苗（酵母）、乙肝基因疫苗（重组乙肝表面抗原疫苗、CHO细胞）、艾滋病疫苗和肿瘤疫苗等。己开发的McAb有72种，多用于治疗难治性疾病如预防移植物急性排斥、免疫性疾病和肿瘤等。8.基因药物：应用于基因治疗目的的DNA片段重组药物。基因治疗:将外源基因导入机体以达到治疗疾病目的。遗传性疾病、肿瘤、艾滋病、囊性纤维变性、糖尿病和心血管病等。我国已批准上市品：IFN-1b（自研），IFN-2a，IFN-2b，IFN-，IL-2，IL-2－125Ser，G-CSF，GM-CSF，SK，EPO，EGF，ECF衍生物，b-ECF，胰岛素，GH，TPO，TNF衍生物，抗IL-8单抗乳膏剂，胸苷激酶基因工程细胞制剂，乙肝疫苗，痢疾疫苗等。细胞:生物有机体形态结构和生命活动的基本单位。第三章细胞工程技术概念细胞工程：以细胞作为研究对象，运用细胞生物学、分子生物学等学科的原理与方法，按照人们的意志设计改造细胞的某些遗传性状，培育出新的生物改良品种或通过细胞培养获得自然界中难以获得的珍贵产品的新兴生物技术细胞培养、细胞融合、细胞重组和遗传物质转移等第一节细胞培养技术细胞培养：生物体内某一块组织，用酶消化法分散成单个细胞，接种至特定的培养容器中并给予必要的生长条件，使其在体外生长繁殖的技术。细胞生长所需的培养条件：1.足够的营养，糖、氨基酸、维生素、无机盐等；2.生长环境，合适的温度、pH值、无菌条件。动物细胞的培养：先在无菌条件下用消化酶将组织分散成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，使其在体外合适的条件下生长繁殖的技术。一、动物细胞培养细胞培养的对象单个的细胞，组织培养的对象组织块（0.5～1mm），器官培养的对象器官的一部分或整个器官。动物细胞分类：（－）动物细胞培养特征贴壁依赖性细胞贴壁大多数动物细胞非贴壁依赖性细胞悬浮血液淋巴细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系兼性贴壁细胞附壁或悬浮1.原代培养（or初次培养，primaryculture）胚胎或出生后几天幼龄动物的脏器获取组织，剪成小块长宽1mm、厚约0.5mm，胰酶消化分散，稀释成2×105～7×105／ml，分装到培养瓶（板）于37℃CO2培养箱内培养。原代培养的细胞特点：离体时间短，一般具二倍体遗传性状，能较好地反映在体内的生长状况适合用作药物测试和细胞分化的研究工具。（二）动物细胞培养技术2．传代培养（或继代培养，subculture）将细胞悬液转接分装到≥两个瓶中培养传代培养。分裂次数：正常细胞有限一般人正常细胞可传代50～60次有限细胞系（finitecellline），传代过程中可无限制生长繁殖的细胞系连续细胞系（continuouscellline）或已确立的细胞系肿瘤细胞（三）动物细胞培养的营养条件1.培养基1）天然培养基成分复杂、来源有限血清、水解乳蛋白、胶原、胚胎浸液等。主含蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、其他对维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学活性不可缺少的未知因子，促进细胞贴壁、中和有毒物质以保护细胞。动物血清：缺点：来源困难，成分不确定，使得细胞生长过程不易检测控制。水解乳蛋白乳白蛋白的水解产物胶原动物真皮（豚鼠、牛）或大鼠尾腱来源的组织提取物胚胎浸液鸡胚和牛胚特点：一定化学组成主要组分：氨基酸、维生素、糖、无机盐、其他一些辅助因子。2.合成培养基根据天然培养基的成分，人工设计模拟合成RPMI-1640、DMEM、TC199、Eagle’sMEM等。只能维持细胞的生存(基础培养基)须补充部分天然培养基，血清一般为10％～20%。①维持细胞生长所需的激素和生长因子胰岛素、生长激素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子②细胞贴壁或铺展所需的细胞因子，纤维粘连素、铺展因子、胎球蛋白等；血清在培养液中的主要作用：提供③识别维生素、脂类、激素和金属的结合蛋白，调节被结合物的活力白蛋白与维生素、脂类、激素结合，将它们载入细胞转铁蛋白结合并传递铁离子，结合蛋白与有毒金属或热原结合则可解除它们的毒性；④细胞生长所需的脂肪酸与微量元素磷脂质、胆固醇、前列腺素等，铜、锌等；⑤蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害；⑥起缓冲作用，保证培养液pH的稳定。不足：成分复杂，含已知或未知成分，研究激素、细胞因子及药物的作用时，干扰分析；产品生产增加细胞培养后产物提取的难度，或影响产品的质量；大规模培养成本过高。①消除因不同批次血清之间的差异而造成的实验误差，保证实验结果的准确性与稳定性；②减少血清中可能存在的支原体、病毒所造成的污染；3.无血清培养基优点与含有