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多肽体外抗氧化——铁氰化钾还原法一．实验原理：样品（蝇蛆多肽提取物）将铁氰化钾（K3Fe(CN)6）还原成亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)，亚铁氰化钾再与三氯化铁反应生成普鲁士蓝（亚铁氰化铁Fe4[Fe(CN)6]3），在700nm测吸光度值，通过测定吸光度来判断受试物还原力的强弱。铁氰化钾溶液为黄色，猜测用三氯乙酸（CCL3COOH）与反应剩余的铁氰化钾生成沉淀，离心除去，排除对吸光度数值的影响。二．查阅文献以确定多肽浓度1．多肽浓度与吸光度完全成直线关系的①②③④2.多肽浓度与吸光度关系不是成直线的（有一点弧度的）此试验浓度太小，担心结果出不来①②因此实验浓度梯度太大，槲皮素出现了抛物线式图形，建议在设置我们的实验时浓度梯度大点，可能有助于得到结果③此实验浓度小，且子实体多肽变化不明显，即在0.3与0.2相同后有出现上升3.自认为有点靠谱的综上所述，自认为多肽浓度暂时设置成0、1、2、4、8、20、40mg/ml但pH值对多肽总还原力的影响，酶与底物比对多肽总还原力的影响，温度对多肽总还原力的影响。以及参考文献中多肽结构含量等与蝇蛆多肽不一致等因素的影响，此浓度设置肯定存在不足。三.试剂的配置四.实验步骤2.5ml样品+2.5ml1%铁氰化钾+2.5mlPH6.6磷酸盐缓冲液（0.2mol/l）50℃水浴加热20min2.5ml10%TCA4000r/min10min上清液5ml+5ml水+1ml0.1%三氯化铁于700nm处测吸光度值，Vc作对照注意：配置不同浓度的样品溶液梯度，依次加入一定量磷酸缓冲液（保证溶液反应的PH环境，如2.5mlpH=6.6）、一定量浓度的铁氰化钾溶液（2.5ml1%），混合均匀，将该体系置于一定温度下（比如：50℃,不能过高，不然会使物质失活，适当加热可以保证反应程度和时间）恒温水浴放置一定时间（如20min，以反应充分为宜），取出加入三氯乙酸溶液混匀，置于离心机内3000转离心10min（离心机使用时一定保证对侧样品等重），取一定量上清液于另一试管中，加入蒸馏水和三氯化铁溶液（3K4Fe(CN)6+4FeCl3→Fe4[Fe(CN)6]3+12KCl，黄色晶体亚铁氰化钾放进三氯化铁的溶液中，产生颜色很鲜艳的蓝色沉淀，即普鲁士蓝，测定吸光度时要摇匀，且普鲁士蓝耐热性在140℃，光照下较稳定，不用避光），混匀后用分光光度计在700nm下测定溶液吸光度。