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核移植技术与动物克隆1一、什么是动物克隆？动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。过程：发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。特点：经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。2精卵结合胚胎细胞个体3核移植技术：利用显微操作技术将一个细胞的细胞移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。4•胚胎克隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎。•体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体的体细胞。核移植技术的分类：5胚胎克隆的操作过程：6显微操作仪78910111.两栖类细胞核移植1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植到去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首次获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代．核供体为囊胚期的胚胎细胞——实验成功核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞——实验失败→→证明早期胚胎核具有发育的全能型121970年JohnGurdon以青蛙脚蹼角质化细胞进行移核试验，蛙卵发育成了蝌蚪。→→证明两栖类分化的体细胞核也具有发育全能性。132.鱼类的核移植从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细胞核的影响．141979年，中国科学院武汉水生物研究所利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细胞经过385天59代连续传代培养后，再将此种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常。151989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。163.哺乳类的细胞核移植1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。17将卵细胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有适量细胞松驰B的溶液中。经此番处理的卵细胞的染色体复制后出现了两个核，将此双核细胞放入正常培养液中培养。卵中的双核细胞自动融合，并且细胞开始分裂。将此种胚胎移入母鼠子宫培育。生产出7只单亲小鼠。181981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将此胚胎移入同步孕鼠子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。19二、核移植技术的一般操作程序核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步骤。211．核受体细胞的准备•受体细胞的种类：卵母细胞、受精卵、2-细胞胚胎。•其中卵母细胞最为普遍。这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。•卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MⅡ卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体，在体外培养成熟后作为受体。22如何给受体细胞去核？◆显微操作◆细胞松弛素结合高速离心◆紫外照射232．核供体细胞的准备细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。24如何获取供体细胞核？◆显微操作◆细胞松弛素结合高速离心核体胞质体253．细胞核移植常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。•胞质内注射是用一个外径5～8μm的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。•透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。．激活正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后,卵母细胞质中会出现一系列的反应,如游离Ca2+浓度增高、母源性的mRNA启动转录、MPF等因子活性下降等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过这些变化,胚胎就不能正常发育。核移植过程中的激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态。。目前，激活的方式主要有：电激活和化学激活重构胚移入受体之前的培养方法有体外培养和体内培养两种方法。275．重组胚的体内或体外培养经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。286．胚胎移植重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。29CellEngineering30CellEngineering31CellEngineering32克隆羊与体细胞核移植3334第一步取妊娠期的6岁母绵羊（FinnDorset白品种母羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用饥饿法使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。35第二步注射促性腺激素，促使母羊（SottishBlackface黑面母绵羊）排卵，28~33小时取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其进入G0期做成受体细胞。36第三步乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流的作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有新的遗传物质的卵细胞。37第四步新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天后发育为桑椹胚或囊胚（8~16个细胞）。38第五步将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下多利即为6岁母羊的复制品，也为白色。39问题：◆3个母亲克隆出多莉，3只公羊能克隆出一只小公羊来吗？◆多莉100％是白面绵羊的复制品吗？40问题：体细胞核移植时，如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体处于同步状态？核全能性的恢复（重编程）？41血清“饥饿”法42实验成功的关键：血清饥饿使细胞核和去核卵细胞处于细胞周期中相匹配的阶段使结合在基因（DNA）上的调控蛋白脱落下来重新编程（reprogram,remodel）4344实验结果424只成体绵羊细胞核移植277个融合细胞（63.8%）移入母羊输卵管成功247个（89.2%）发育到桑椹期的胚胎29枚(11.7%)植入13只母羊子宫后1头羊怀胎产出总成功率0.23%45克隆动物的鉴定：DNA指纹：指每个个体所特有的基因多态性鉴定方法：RAPD微卫星RFLPDOLLY的鉴定：微卫星46为何是突破性的工作：第一，解决了使供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）同步的方法。第二，解决了用体细胞做核供体与转基因的问题。47克隆羊成果的重要生物学意义：第一，证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。对于动物来说，随着分化的演进，细胞逐渐丧失其分化能力：全能性→多能性→单能性→分化成熟的体细胞48第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。它的成功提示我们可以进一步做到，在培育体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就是说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。49第三，在现代生物学领域中，沿有任何一项研究成果能够比通过对基因进行有规律地控制而解决更多的问题的先例。多利羊的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。50目前已经克隆出的动物三、核移植技术的应用1．制备转基因克隆动物，进行生物药物生产；2．培育优良畜种，扩大良种种群；3．开展异种动物克隆，拯救濒危动物；4．与干细胞技术结合，开展治疗性克隆5．利用核移植技术，研究生物学的基本问题。52生殖性克隆53治疗性克隆细胞治疗组织替代器官移植54培育各种疾病动物模型应用核移植技术可以培育基因完全一致的实验动物模型，为遗传学，病理学研究提供良好的实验材料。动物种类疾病模型数猪65猫123狗20355四、克隆技术存在的问题理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。56实践问题克隆动物的成功率还很低生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象57除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。58CCTV关于克隆人的一个科普节目：