45KOD_Plus-Neo高保真PCR酶

10-04高保真•高效率•高速PCR酶KOD–Plus-Neo(Code:KOD-401)科研用TOYOBOCO.,LTD.LifeScienceDepartmentOSAKAJAPAN目录【1】简介.................................................................................................................................................1【2】PCR实验步骤...............................................................................................................................3【3】进行实验的注意事项.....................................................................................................................6【4】性能数据.........................................................................................................................................7【5】实验例.............................................................................................................................................9【6】常见问题.......................................................................................................................................10【7】参考文献.......................................................................................................................................11【8】相关产品.......................................................................................................................................11【注意】该系列产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。【保存】所有组分请均保存于-20℃条件下。【1】简介KOD-Plus-Neo是在来源于鹿儿岛县小宝岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌ThermococcuskodakaraensisKOD1株的KODDNAPolymerase1,2)的基础上开发的PCR用酶｡由于KODDNAPolymerase具备强力的3´→5´Exonuclease活性（Proofreading活性），可表现出很高的保真性，最适用于克隆目的的PCR｡而本产品通过在KODDNAPolymerase中添加独有的延伸增强剂，在保持原产品KOD-Plus-（CodeNo.KOD-201）、KOD-Plus-Ver.2（CodeNo.KOD-211）优良的保真性（约为Taq的80倍）的同时，扩增量和延伸性得到了显著的提升。此外，延伸时间从原来的1min./kb缩短到30sec./kb，大大缩短了PCR所需时间。本酶混合了抑制Polymerase活性和3’→5’Exonuclease活性的两种单克隆抗体，可简便地进行高特异性的HotstartPCR。特征●可对微量模板进行高保真・高效率的扩增KOD-Plus-Neo中添加了本公司独有的延伸增强剂*，即便是微量模板也可对目的基因进行高保真・高效率的扩增。本酶的保真性约为Taq的80倍，也可对低拷贝数模板的目的基因进行高保真性的扩增。*KODDNApolymerase等高保真性PCR酶在20～30循环以后，很容易出现扩增无法持续的停滞现象。延伸增强剂可抑制该停滞现象，使反应更持久。因此，对微量模板、长片段的扩增可发挥显著的效果。●实现了各种引物同一循环条件无需摸索循环条件。20mer以上的引物（Tm值*＞63℃）可先尝试2步法。无需摸索条件非常简便。010203040停滞现象以往的PCR酶KOD-Plus-Neo延伸增强剂的效果图1延伸增强剂的效果010203040停滞现象以往的PCR酶KOD-Plus-Neo延伸增强剂的效果图1延伸增强剂的效果*引物Tm值的计算请使用最邻近法（NearestNeighbormethod）。本说明书中记载的引物Tm值是在50mMNa+浓度与0.5μM寡核苷酸（Oligonucleotide）浓度条件下计算而得。Primer20mer以上（最好22mer以上）Tm63℃Tm≦63℃2步循环3步循环*无扩增StepDown循环非特异性扩增*退火温度设定为引物的Tm值Primer20mer以上（最好22mer以上）Tm63℃Tm≦63℃2步循环3步循环*无扩增StepDown循环非特异性扩增*退火温度设定为引物的Tm值扩增产物的量东洋纺(上海)生物科技有限公司垂询电话：[phone]●缩短了扩增时间（长目的片段更方便）延伸时间从原产品的1min./kb缩短到30sec./kb。由于提高了延伸性，可更迅速地对长片段进行扩增。●可对各种目的片段进行扩增相比以往产品提高了延伸性，可扩增各种长目的片段。已确认可对17.5kb的人基因组DNA模板进行扩增。此外，在反应液的Mg2+浓度为2mM的条件下，可对24.0kb的人基因组DNA模板进行扩增。◆产品组成KOD-401(200U×1)KOD-401BKOD-Plus-Neo(1.0U/μl)200μl×110×PCRBufferforKOD-Plus-Neo1ml×125mMMgSO41ml×12mMdNTPs1ml×1(KOD-401)×5◆安全上的注意事项本产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床检测试剂使用。使用本产品请严格遵守实验室的一般注意事项，注意安全。在相关实验中，有可能还会用到对人体有害的试剂。请务必注意各试剂添附的组分及其相关注意事项，并遵守各仪器･器具添附的使用说明书的指示，使用必要的保护用具，注意安全。◆性能･品质各批号的KOD-Plus-Neo均对人基因组DNA模板β-globin基因内17.5kb片段进行扩增确认实验后再销售。【2】PCR实验步骤1.引物设计・请尽量使用22~35mer（Tm值*＞63℃）的引物。・GC含量请设计为45~60%。并请确认GC的位置（偏向）。GC如靠近3’端，则容易出现弥散、杂带等现象。（按5’端一侧的为60~70%,3’端一侧的为40~50%制作比较理想。）・3’末端设计为G或C可提高引物与模板结合效率。但如前所述，如果GC过于偏向3’端，则容易出现弥散、杂带等现象，请注意。・请注意不要使其形成分子内二级结构､引物二聚体等现象｡・扩增长片段时，请使用长度为25~35mer、Tm值为65℃以上的引物。使用25mer以上（Tm值≧65℃）的引物成功率较高。・请注意避免使用含次黄苷酸（inosineacid）的引物。*引物Tm值的计算请使用最邻近法（NearestNeighbormethod）。本使用说明书中所记载的引物Tm值是在50mMNa+浓度与0.5μM寡核苷酸（Oligonucleotide）浓度条件下计算而得。2.PCR反应液的配制配制反应液前，请充分混刀各试剂。冻结的试剂请完全解冻后再使用｡ComponentsVolumeFinalConcentrationAutoclaved,distilledwater(33-X)μl10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo5μl1×2mMdNTPs5μl0.2mMeach25mMMgSO43μl1.5mM引物(10μMeach)1.5μl0.3μMeach模板XμlGenomicDNA~200ng/50μlPlasmidDNA~50ng/50μlcDNA~200ng/50μlKOD-Plus-Neo(1U/μl)1μl1U/50μlTotal50μl・所有液体添加以后，请用Vortex等充分混刀，再进行PCR。・一般情况下Mg2+浓度请用1.5mM（终浓度）。・以逆转录反应液为模板的情况下，逆转录反应液中过量的RNA会抑制PCR反应。PCR反应体系为50μl时添加的逆转录反应液量，首先请尝试RNA量为50ng（用TotalRNA1μg，在20μl容量下进行逆转录反应时，取反应液1μl）左右。・模板的详细说明请参照【3】1（p.6）。东洋纺(上海)生物科技有限公司垂询电话：[phone].PCR循环条件[重要事项]◆KOD-Plus-Neo的循环条件，以两步法为基本循环，条件的设定非常简便。对于Tm值较低的引物，如果Tm值高于63℃，一般退火温度都设计为68℃，先尝试下面的两步法。1)两步法引物的Tm值高于63℃的情况下，请用两步法。2步法Predenature:94℃,2min.Denature:98℃,10sec.Extension:68℃,30sec./kb・如果目的片段的拷贝数较少，或扩增长片段时，请尝试30~45循环。・延伸（Extension）时间请按照30sec./kb设定。・目的片段的拷贝数较少，或目的片段超过10kb的情况下，延伸时间延长为1min./kb。同时，如果把反应液的Mg2+浓度设为2mM则可增加扩增量。・把DNA变性（Denature）设为94℃･15sec.，可增加目的片段的扩增量。GCrich的目的片段的变性条件请设为98℃･10sec.。・添加DMSO时，请用三步法，或使用25~35mer、Tm值68℃以上的引物。引物的Tm值低于68℃的情况下，两步法时DMSO的添加量请在2%以下。25～45cyclesPrimer20mer以上（最好22mer以上）Tm63℃Tm≦63℃2步循环3步循环*无扩增StepDown循环非特异性扩增*退火温度设定为引物的Tm值Primer20mer以上（最好22mer以上）Tm63℃Tm≦63℃2步循环3步循环*无扩增StepDown循环非特异性扩增*退火温度设定为引物的Tm值)其他循环引物的Tm值在63℃以下，或用两步法无法确认到扩增时，请尝试用三步法。此外，当扩增产物出现杂带或弥散时，请尝试Stepdown。三步法Predenature:94℃,2min.Denature:98℃,10sec.Annealing:(Tm)℃,30sec.Extension:68℃,30sec./kb・退火温度请设定为引物的Tm值。StepdownPredenature:94℃,2min.Denature:98℃,10sec.Extension:74℃,30sec./kbDenature:98℃,10sec.Extension:72℃,30sec./kbDenature:98℃,10sec.Extension:70℃,30sec./kbDenature:98℃,10sec.Exten