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【一】【常用仪器简介】常用实验仪器的名称和功能介绍⑴刻度吸管⑵量筒⑶取液器⑷普通试管⑸分光光度计⑹紫外分光光度计⑺平衡天平⑻离心机⑼电热恒温水温箱⑽电热恒温水浴锅⑾电泳仪⑿电热恒温振荡箱⒀PH仪⒁酶联免疫检测仪⒂漩涡混合器综合性仪器设备的名称和功能介绍⑴生化半自动分析仪⑵尿液分析仪⑶PCR仪⑷凝胶成像分析系统⑸蛋白质测定仪⑹荧光倒置显微镜⑺T6紫外可见分光光度计【示教：刻度吸管的正确使用方法】①拿法：右、左手的拇指和中指拿住刻度吸管离平口端约5.0cm处，食指轻轻放于吸管口。②取量：将刻度吸管管尖插入液体面以下约1cm，利用洗耳球负压吸取液体至最高刻度以上，然后迅速用食指按紧吸量管管口，使液体不致从管内流出。③调刻度：将已经充满液体的吸量管提出液面，用滤纸小片擦干吸量管外面的液体。然后持吸量管与地面保持垂直，放松食指控制液体缓慢地下降，刚好至最上一刻度，立即按紧吸量管管口。④放液：使吸管尖端轻轻接触受器内壁，然后放松食指，让液体缓慢流入受器内（让液体缓慢地下降至所需刻度处）。【⑵取液器的使用】取液器多为可调式，又可以分为分档调节和连续调节两类。①原理：是利用排代原理，由活塞在活塞套内作定程运动，产生负压，吸入定量液体。②特点：具有使用方便，性能可靠之优点。③分型：可分为1ul、2ul、5ul、10ul、25ul、50ul、200ul、250ul、500ul、1000ul、5000ul等多型。④使用方法：A、将吸液管套在取液器头上，轻轻转动，以保证密封。B、使用前应先将取液器吸液和排液数次，以保证内外气压相一致。C、垂直地握住取液器，将按钮按到第一停止点，并把吸液管尖浸入到液面下2-3mm，再均匀缓慢地放松按钮，使之复位，等待1-2秒钟后从液体中取出，并避免碰撞任何物体。D、将吸液管移至加样容器壁上，缓慢地把按钮按到第一停止处，等待1-2秒钟，再把按钮完全按下，排尽全部液体后，吸液管尖应沿容器壁向上滑动取出，再放松按钮，使之复位，即完成取液操作过程。E、取液器的存放：取液器使用后如果将在较长一段时间不再使用，在放置前应将取液器的取量数调至最大，以防复进弹簧长期压缩而变形，使其功能尽失。【⑷试管内液体的常用混匀法】①旋转法：液体较多时常用次法。右手拿试管上端，利用手腕力量使试管作圆周运动。顺时针或逆时针方向转动都可以，但必须是一个方向。②指弹法：左手持试管上端，使试管大致垂直于地面，再用右手食指轻轻弹动试管（即右手食指与试管壁成切线运动）使试管内液体呈漩涡状转动。液体较少时可采用此法。③甩动法：右手握住试管上端，将试管倾斜来回甩动，使试管内液体呈漩涡状转动。此法只适用于少量液体的混匀。④倒转法是一次性塑料试管的常用方法、将试管在离管口约2cm处进行180°折叠，然后将试管倒转数次即可。⑤漩涡混匀法是使用一系列3ml容量以下的或EP管之类小试管，难于用以上4种方法进行液体混匀的情况。【二】【静脉采血】1、采血部位一般采用肘前静脉，肘前静脉不明显时，可采用手背静脉或踝部静脉。小儿可用颈部静脉采血。必要时可从股静脉、大隐静脉、锁骨下静脉、脐旁静脉、肘前动脉等处采血。但这些部位采血，必须在有经验者指导下进行，或由临床医生采集，以免发生意外。2、采血及血清制备器材一般用2、5ml或10ml注射器，针头口径的大小可视具体情况而定，选用6或7号针头，用前必须严格高压灭菌；橡胶管压脉带、垫枕、75%乙醇、25g/L碘酊和无菌棉球（棉扦）等。试管、平衡天平、离心机、取液器。3、采血方法（肘静脉采血）⑴首先选择适宜静脉，在上臂扎上压脉带（离穿刺部位约5cm）。用25g/L碘酊，对穿刺部位皮肤进行由内向外的环形消毒。待碘酊干后，再用75%乙醇棉扦以同样方法擦去碘迹。嘱患者紧握拳头，使静脉显露。取无菌注射器，检查针头是否安牢，有无阻塞和漏气，将注射器活塞来回抽动数次，保持内外压力一致，将针头斜面和针筒刻度旋至同一向上面上。⑵左手拇指固定静脉穿刺部位的下端，右手持注射器，使针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉正面将针头斜行（行针与体表成15~30度夹角），快速穿过皮肤，刺入静脉腔中央。见回血后，将注射器成10度前行0.5cm后立即固定注射器，以免针头滑出血管。用左手缓缓抽动注射器针栓，至所需血量后解除止血带，放松拳头，用无菌棉签压住穿刺孔，拔出针头。⑶嘱咐献血者弯曲手臂压住棉签2~5分钟，直至穿刺孔血液凝固，防止皮下出血形成渗血包块。⑷盖上针帽，取下针头，将血液沿试管壁缓慢注入试管内，置室温任其凝固(或置37℃孵箱或电热恒温水温箱)。【血清的制备】待血液凝固收缩后（或置37℃孵箱或电热恒温水温箱）析出淡黄色透明液体，即可分离血清（可用离心机3000n/分钟离心5分钟）。如果需要全血或血浆，则将血注入事先准备的抗凝管中，轻轻混匀，防止凝固，即为抗凝血。经适当离心沉淀后，淡黄色上清液即为血浆。血清和血浆的主要区别是，血清中失去了纤维蛋白原及凝血因子。【5.安全防护】⑴给已使用过的注射器针头盖上针帽时应特别小心，防止针头扎破手指。⑵针头刺破伤的处理：①自来水直接冲洗；②皂液清洗；③注射抗破伤风液。⑶防血液污染：工作服、手套、眼护罩。若有沾染应及时清洗。【血清总胆固醇的测定Total-CholesterolAssayofserumKit】【实验原理】血清中的脂化胆固醇经胆固醇酯酶水解产生脂肪酸和游离胆固醇，与原有的游离胆固醇一同被胆固醇氧化酶氧化生成4-胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化物酶使过氧化氢分解出氧的游离基，它将4-氨基安替比林和酚氧化为红色醌型化合物，在510nm波长测定吸光度值，计算其含量。【计算】胆固醇校准液浓度C=5.0mmol/LC测=参考值：3.1～5.7mmol/L临床意义：1、胆固醇升高：（1）胆固醇（高胆固醇血症）和动脉粥样硬化的发生有密切关系，胆固醇升高容易引起动脉粥样硬化性心、脑血管疾病，如冠心病、心肌梗死，脑卒中等。作为评价动脉粥样硬化的危险因素，而最常用做动脉粥样硬化的预防、发病估计、治疗观察等的参考指标。（2）胆固醇升高见于各种（摄入）高脂蛋白血症、梗阻性黄疸（胆汁排出受阻）（肝内胆固醇合成亢进-游离胆固醇增加）、肾病综合征、甲状腺功能低下、慢性肾功能衰竭、糖尿病等时。此外，吸烟、饮酒、紧张、血液浓缩等也都可使血液胆固醇升高。妊娠末三个月时，可能明显升高，产后恢复原有水平。2、胆固醇降低：可见于各种脂蛋白缺陷状态、肝硬化（肝细胞受损）、重症肝炎、恶性肿瘤、营养吸收不良、巨细胞性贫血等。此外，女性月经期也可降低。方法学评价1、空白吸光度A510nm＜0.12、线性范围0～10.4mmol/L（R大于0.99）3、重复性测量精密度≤4.0%；批间差≤5.0%4、准确性在质控品的sx2。5、氧化酶法测定血清总胆固醇，特异性好、灵敏度高。注意事项：1、标准液防止污染，2～8℃密封保存2、工作试剂防止葡萄糖和甘油三酯的污染。3、比色应在30min内完成。【血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳】电泳技术电泳技术主要用于物质性质的研究、种类的鉴定、分离纯化、纯度的分析等实验研究工作中，已成为生物化学、分子生物学、医学、药学、农业、食品、卫生、环保等学科不可缺少的重要的分离分析手段。一、电泳技术的原理电泳是指在外加电场的作用下，带电的物质向其所带电荷相反的电极方向移动的现象。各种物质由于所带净电荷的种类和数目不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同，从而可以对物质进行分离、分析和鉴定。1．带电粒子在电场中移动时，受到两种力的作用。第一种是电场产生的作用力F1，它能使带电粒子移动。F1的大小与粒子所带静电荷q及电场强度E成正比。第二种是移动的带电粒子与溶液介质之间产生的摩擦力F2，它可以阻止带电粒子的移动。F2的大小与带电粒子的摩擦系数f及运动速度v成正比。F1=q·EF2=f·v2．根据Stokes定律，摩擦系数f与介质的粘度η、粒子的形状和大小（球形粒子半径为r）有关，即f=6πηr。3．在电场中运动的粒子，其所受到的电场力和摩擦力平衡，即q·E=6πηr·v。变换该式得：q·Ev=————6πηr因此，带电粒子在电场中运动的速度与它所带的静电荷及电场强度成正比，和溶液的粘度与粒子的大小成反比，即在相同的电泳条件下，只要粒子所带的净电荷不同，或粒子的大小不同，就有可能借助电泳而被分离。4．我们通常使用电泳迁移率M来表示在单位电场中颗粒的迁移速度，即tELEtLEVM/因此，对于给定的颗粒和电泳条件，电泳迁移率是描述物质在电泳中行为的特征性常数，它表示带电粒子在单位电场强度E和单位时间t内泳动的距离L。二、影响电泳迁移率的因素1．缓冲溶液缓冲溶液应选用使分离的物质稳定，而且不与其发生反应的体系。缓冲液的pH直接影响分子的解离和带电性质、状态，因而会影响迁移率和分离效果。缓冲液的离子强度应在0.05～0.10mol/L间为宜，过低，产热少，电泳快，区带明显扩散；过高，区带尖锐，泳动距离短，产热多。离子强度可用μ表示。（配动图）2．电场带电粒子在电场中的移动速度，与电势梯度成正比。两端间的距离电泳两端的电势差电势梯度因电场中施加的端电压不同，而分为常压和高压电泳。一般在500V以下为常压电泳，电势梯度10～20V/cm；500V以上为高压电泳，电势梯度20～200V/cm。高压电泳会产生大量的热，所以高压电泳仪有配套的冷却装置和安全防护装置。3．支持介质支持介质解决了样品扩散问题。一般选用惰性材料，不影响粒子在电场中的迁移率。但有的支持介质仍对样品有吸附和滞留作用，将造成分离物的拖尾现象，影响分辨力。有的支持介质具有电渗作用。所谓电渗是指一种液体相对于带电的支持物的移动现象。是由于支持介质内存在某些可解离的基团所致，将影响带电粒子在电场中的泳动速度或泳动方向。此外，有的支持介质具有分子筛作用，可根据待分离物的分子大小，采用不同的交联度以形成孔径不同的凝胶。粒子在这种介质中电泳时，迁移率不仅与其带电性质有关，而且与它们的分子大小有关。三、醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳采用醋酸纤维素薄膜为电泳的支持介质，具有操作快捷简便、染色和脱色较易、背景清晰、区带分明、样品需要量少、介质可以透明后定量扫描等优点，主要用于生物大分子物质的分离分析。血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳一、原理以醋酸纤维薄膜为支持物，浸入ph8.6的缓冲液后吸去多余液体。将微量血清点于膜上，经电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，洗去多于染料。将膜条烘干，再将其用透明液进行透明处理。用光密度计或凝胶成像系统进行成分分析比较。二、操作1、准备与点样⑴将薄膜切成28cm的膜条。在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔划一线，表示点样的位置。⑵将薄膜无光泽面向下，浸泡于巴比妥缓冲液中。⑶将充分浸透（指膜上没有白色瘢痕）的膜条取出，用滤纸洗去多余的缓冲液。⑷用X光软片在盛有血清的表面皿中蘸一下，使软片下端粘上薄层血清，在表面皿边缘轻轻刮除多余的血清，然后紧按在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内，移开软片。2、电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置阴极。槽架上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟通电，电压为10V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为0.4~0.6mA/cm宽，通电一小时左右关闭电源。3、染色通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2~3分钟取出，自来水冲去多余染料，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂洗白净为止。用滤纸吸干薄膜。4、定量将吸干的膜条放入干燥箱中，烤干后，放入盛有透明液的培养皿中让其充分浸透，用镊子将其取出，迅速平整的将膜条贴敷于载玻片上，让其自然透明，再将透明的膜条连带载玻片一同放入光密度计或凝胶成像系统中进行定量分析，从而求得各部分蛋白质的百分数。三、临床意义1、正常值：白蛋白57~72%α1球蛋白2~5%α2球蛋白4~9%β球蛋白6.5~12%γ球蛋白12~20%2、异常时：⑴慢性肝炎和肝硬化：白蛋白显著降低，α2和β球蛋白无显著变化，γ球蛋白升高2~3倍。⑵肾病综合