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第四章1.杂交瘤技术原理：以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。2.细胞株冻融的原则：快冻慢融。目前均采用液氮保存杂交瘤细胞。细胞放入液氮前需要逐步降温，如果冻存管放置于-80摄氏度低温冰箱过夜后再放入液氮中，可长期保存。复苏细胞时，冻存管取出后，立即37摄氏度水浴，使之融化。第五章1.凝集反应：是指细菌和红细胞或红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。直接凝集反应：在适当电解质参与下，细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原直接与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象，称为~。间接凝集反应：可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体（如正常人O型红细胞、细菌、胶乳颗粒等）的表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在适宜的电解质存在条件下出现特异性凝集现象，称为~。其敏感度高于直接凝集反应和沉淀反应。正向间接凝集反应：用可溶性抗原致敏载体以检测标本中的待检抗体。反向间接凝集反应：用特异性抗体致敏载体以检测标本中的待检抗原。间接凝集抑制反应：用抗原致敏的载体颗粒及相应的抗体作为诊断试剂，检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。2.抗人球蛋白试验的类型及其原理。原理：Coombs试验又称抗人球蛋白试验，用于检测红细胞不完全抗体，其原理是：不完全抗体多半是7S的IgG类抗体，能与相应的抗原牢固结合，但因其分子量较小，体积小，不能起到桥联作用，在一般条件下不出现可见反应，利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，可使红细胞凝集。Coombs试验有二种类型：(1)直接Coombs试验：用于检测红细胞结合的不完全抗体。将抗人球蛋白试剂直接加到表面结合抗体的受检红细胞中，即可见细胞凝集。常用于检测新生儿溶血症，自身免疫性溶血症，特发性自身免疫性贫血的患者红细胞上不完全抗体。(2)间接Coombs试验：用于检测血清中游离的不完全抗体。将受检血清和具有相应抗原性的红细胞相结合，再加入抗人球蛋白抗体即可出现可见的红细胞凝集。多用于检测母体RhD抗体，红细胞不相容输血后产生的血型抗体。3.沉淀反应：是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。4．双向免疫扩散试验：原理：是将抗原核抗体加在同一琼脂板的对应孔中，各自向对方扩散，在浓度比例恰当处形成沉淀线。观察沉淀线的位置、形状及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。应用：1.判断抗原或抗体的存在以及估计相对含量。沉淀线靠近抗原孔，说明抗体浓度较大；靠近抗体孔则说明抗原浓度大。2.分析抗原或抗体相对分子量。形成的沉淀线弯向分子量大的一方。3.分析抗原的性质。（待测物为两种抗原）两条沉淀线互相吻合相连，两抗原中存在相同表位；两条沉淀线交叉，说明两抗原完全不同；两条沉淀线相切，提示两抗原之间有部分相同。4.抗体效价的滴定。5鉴定抗体或抗原纯度。5.免疫固定电泳（IFE）：原理：实质是区带电泳和沉淀反应相结合。先将血清蛋白质置于琼脂凝胶中进行区带电泳分离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加于凝胶表面的泳道上，经过孵育，固定剂和抗血清在凝胶内渗透、扩散，抗原抗体直接发生沉淀反应，洗脱游离的抗体，形成的抗原抗体复合物则保留在凝胶中。经氨基黑，参考泳道和抗原抗体沉淀区被着色，根据电泳移动距离分离单克隆组分，可对各类Ig及其轻链进行分型。应用：最常用于M蛋白的鉴定与分型。。荧光免疫技术：是将抗原抗体反应与荧光技术相结合而建立的一种免疫荧光技术，具有高度特异性、敏感性和直观性。第七章1.荧光：荧光物质吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为~。①发射光谱：是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的谱图②激发光谱：是指固定检测发射光（荧光）波长，用不同波长的激发光照射样品得到的荧光的谱图。③荧光效率：是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）④荧光猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。2.荧光色素：异硫氰酸荧光素FITC，黄绿色荧光，应用最广泛。RB200：四乙基罗丹明，橘红色。PE：藻红蛋白，红色，流式荧光免疫技术中PE与FITC可用于双标记免疫荧光染色。3.荧光显微技术原理原理：又称荧光抗体技术，采用荧光素标记抗体与标本片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测或对自身抗体进行定性和低度检测，此技术亦称荧光免疫组织化学技术。第八章1常用的酶：1.辣根过氧化物酶（HRP），应用最广泛，强酸是其强烈抑制剂，采用硫酸作为反应终止剂。避免使用叠氮钠作为酶标复合物的防腐剂。2.碱性磷酸酶（ALP），含磷酸盐的缓冲液对酶具有抑制作用，不能用磷酸盐缓冲液PBS3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）常用的底物：1.HRP有邻苯二胺（OPD），最敏感，显橙黄色，硫酸终止后呈棕黄色、四甲基联苯胺（TMB），最常用，作用后显蓝色，终止后变为黄色。2.ALP有对-硝基苯磷酸酯（p-NPP），用NaOH作为反应终止剂。3.β-Gal有4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷（4MUG）。常用的标记方法：交联法（戊二醛~）和直接法（改良过碘酸钠法）固相载体的选择：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜载体2.酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：把抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性，即形成固相抗原或抗体；将抗原或抗体与酶连接成酶标记抗原或抗体，它既保留了免疫活性，又保留了酶的活性；在测定时，把受检标本（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体表面的抗原或抗体起反应形成固相化抗原抗体-酶复合物，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体-酶复合物与其它成分分离，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被固相载体上的酶催化生为有色产物，通过定性或定量检测有色产物的量即可确定样品中待测物质的含量。方法类型：ELISA检测抗原的方法主要有：①双抗体夹心法：适用于至少两个抗原决定簇（AD）的Ag。先将特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体，加入待测标本并温育，使标本中的抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗涤去除其他游离成分；然后加入酶标记抗体并温育，使固相抗体抗原复合物与酶标记抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，为“双抗体夹心”；洗涤去除游离酶标记抗体。加入底物，固相载体结合的酶可催化底物成为有色产物，根据产物的显色程度进行抗原的定性或定量检测。临床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人绒毛膜促性腺激素HCG等项目的检测。②双位点一步法：该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的抗原决定簇，分别制备两种单克隆抗体，在包被时使用一种单抗，酶标记时使用另一种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标记抗体同时加入反应体系，两种抗体分别与不同的抗原决定簇结合，只进行一次温育，在洗涤后即可加底物进行显色反应。担当待测抗原浓度过高时，可出现钩状效应，甚至出现假阴性结果，必要时可将标本适当稀释后重新测定。）③竞争法：原理：先用特异性抗体包被固相载体，然后同时加入待测抗原和酶标记的抗原，待测样本中的抗原与酶标记抗原竞争性的与固相载体上的特异性抗体结合，温育一段时间后洗涤，加入底物显色。应用：适用于小分子Ag或半抗原（只有一个AD）。（二）ELISA检测抗体的方法主要有：①间接法：检测Ab最常用的方法。常用酶标记羊抗人IgG。②双抗原夹心法：灵敏度和特异性高于间接法，原理类似双抗体夹心法，操作步骤也基本相同，也可采用一步法，但一般不会出现钩状效应。临床上乙型肝炎表面抗体HBsAb的测定常用此法。③竞争法：当相应抗原材料中含有难以去除的杂质，不易得到足够的纯化抗原或抗原性质不稳定时，可采用此方法。主要用于测定HBcAb和HBeAb。原理见下：（1）HBcAb的竞争法：先将核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原，，然后加入待测标本和酶标记的特异性核心抗体，此时待测标本中的HBcAb与酶标记HBcAb竞争性地与固相载体上的核心抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色的强弱与待测标本中的HBcAb的含量负相关。（2）HBeAb的竞争法：先将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体，同时加入待测标本和中和抗原HBeAg，此时待测标本中的HBeAb和固相抗体竞争性地结合中和抗原HBeAg，温育后洗涤，加入酶标记的HBeAb，酶标记抗体与结合于固相抗体上的特异性抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色强弱与待测标本中HBeAb的含量呈负相关。④捕获法：又称反向间接法，主要用于血清中特定Ig类别的测定，最常用于病原体急性感染诊断中IgM型抗体检测。原理：首先将针对IgM的第二抗体包被于固相载体形成固相抗体，加入待测标本后，标本中所有的IgM（特异/非特异）即可被固相抗体捕获。第二步加入特异性抗原，其与固相载体上捕获的IgM特异性抗体结合，再加入针对特异性抗原的酶标记抗体，形成固相抗人μ链IgM-抗原-酶标记抗体复合物，最后加入底物显色，即可对待测标本中抗原特异性IgM进行定性或定量测定。此法临床上常用于病原体急性感染的实验室诊断，如急性甲肝时可检测HAV-IgM抗体，急性乙型肝炎时可检测抗HBc-IgM抗体。第九章1.发光免疫分析（CLIA）：是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。兼有高灵敏性和高特异性。2化学发光剂：在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，成为~或发光底物。能作为化学发光剂的有机化合物必须具备下列条件：1.发光的量子产率高。2.它的物理化学特性要与被标记或测定的物质相匹配。3.能与抗原或抗体形成稳定的偶联化合物。4.其化学发光常是反应的结果。5.在所使用的浓度范围内多生物体没有毒性。3.直接化学发光剂：鲁米诺和吖啶酯（常用）间接化学发光剂：酶促反应的发光剂：鲁米诺及其衍生物、AMPPD。酞菁/二甲基噻吩衍生物/Eu螯合物4..发光剂的标记技术常用标记方法：碳二亚胺缩合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法影响标记的因素：发光剂的选择、被标记蛋白质的性质、标记方法的选择、原料比、标记率、温度、纯化与保存。5.电化学发光免疫分析（ECLIA）【特点】：①三丙胺作为电子供体，三联吡啶钌在电场中因不断得到三丙胺提供的电子，可周而复始的发光，持续时间长，信号强度高，容易测定、控制；②三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的理化特性；③试剂灵敏度高，稳定性好。吖啶酯及酶促反应发光剂的原理自己看第十章生物素-亲合素系统【特点】：高特异性、高敏感性、稳定强、实用性强【应用】：在标记免疫技术中可应用于标记信号放大环节，也可用于固相包被（或分离）环节一、应用于固相载体的包被环节二、应用于检测系统的信号放大第十一章1.固相膜免疫分析技术：是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜也可以通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶标记或各种有色微粒子（如彩色胶乳、胶体金或胶体硒等）标记抗体或抗原作为标记物，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。2.胶体金免疫技术：是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。技术类型：斑点金免疫渗滤试验、斑点金免疫层