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第九章活性氧和氮物种的合成与代谢朱小桢（译）最近的25年，在运动生理学中，活性氧和氮物种的作用已受到了相当大的重视。现已证明，重体力活动可通过多种机制诱导增强氮物种的产生。在这种背景下，氮物种的产生似乎影响到运动生理学研究中的重要机制。有证据表明,为应对剧烈的体力活动而形成活性氧和氮物种会导致氧化应激。然而,运动引起氧化应激的功能意义仍然是值得商榷的。最近的一些研究揭示了活性氧和氮物种作为信号分子的重要作用。在这种背景下,活性氧和氮物种调节一系列生理功能。活性氧和氮物种调节未疲劳和疲劳的骨骼肌收缩功能。活性氧和氮物种通过氧化还原敏感性转录因子调节基因表达是一个重要的调节机制，这被认为是参与训练的适应过程。内源性抗氧化系统针对定期训练而产生的适应可能会导致运动诱导的氧化应激的限制，并反映出是增强运动耐受性的潜在机制。训练的效果似乎也包括活性氧和氮物种生成的改变，这可能在慢性疾病的治疗和预防过程中发挥有益作用。目前，许多关于运动对活性氧和氮物种相关机制在人类细胞水平上的影响的可用数据，来源于外周免疫活性细胞的研究。因此，免疫学方面的内容是本章的一个重要组成部分。本章的第一部分提供了有关活性氧和氮物种的基本知识，集中在他们的生成特性、作用机制、参与的生理功能、以及构成抗氧化系统。第二部分介绍了当前关于急性和慢性运动在形成、作用、调节活性氧和氮物种特性上的具体影响，以及抗氧化系统产生反应的知识。生物体内的活性氧和氮物种根据定义，自由基是在其轨道中存在具有非常明显的化学活性的一个或多个不成对电子的原子或分子（哈里维尔1998）。通常，用一个点（.）来象征自由基物质。额外的氧化衍生物没有不成对的电子被归类为非自由基。这样的非自由基与自由基相比，也发挥氧化作用和具有相似的反应活性及调节作用（德勒格2002）。图9.1总结了活性氧和氮的主要类型，特别是对于其生成酶控制的，非酶促的，和铁或铜催化的机制已显示负责。化学反应性和产生的毒性靶细胞在不同类型活性氧和氮物种之间是不同的。迄今为止，活性最强的含氧物质是羟自由基（·OH-）（哈里维尔1998）。超氧阴离子（.O2-）是生物相关的活性氧中最彻底的研究。基础条件下，身体产生的总的.O2-已计算为接近2公斤/年（哈里维尔1998）。由亚硝酸盐和硝酸盐的定量测量，已证明一氧化氮（.NO）在大量生成，达到9公斤/年（哈里维尔1998）。活性氧和氮物种产生的机制一个术语之间的区别是：以氧为中心的活性氧（ROS）和氮衍生的活性氮（RNS），而术语活性氧和氮物种则统一了这两个种类。有几中机制被认为是负责合成活性氧和活性氮的。氧为中心的活性物种及其衍生物通过NADPH氧化酶亚基产生超氧阴离子是一个机制，其存在于吞噬细胞和多种其它细胞中，例如血管平滑肌细胞、内皮细胞、心脏和骨骼肌细胞以及成纤维细胞（Griendling等人，1994；Javesghani等人，2002；Jones等人，1996）。由非吞噬细胞中的NADPH氧化酶形成的活性氧程度较低，而在氧化还原敏感性信号传导途径的调节中起着重要的作用。NADPH氧化酶活化的心血管亚型，已被证明发生在代谢、血液动力学，和荷尔蒙的变化反应中（Droger2002）。血小板源性生长因子、凝血酶、和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激血管平滑肌细胞的NADPH氧化酶，而内皮细胞对机械力作出反应。最近，在大鼠的实验中显示，一个非线粒体NADPH氧化酶酶复合物存在于骨骼肌纤维内部。它具有类似于非吞噬细胞的NADPH氧化酶的特性，并有助于骨骼肌基底活性氧的形成。（Javesghani等人2002）。超氧自由基（.O2-）通过线粒体电子传递链氧化还原反应的半醌化合物连续地产生。在线粒体氧化磷酸化的过程中，分子氧发生四电子还原。这反一应是由细胞色素氧化酶催化的，并用于大约90％至98％的氧气消耗。其余的氧发生单价还原形成超氧阴离子.O2-(哈利韦尔1998），这一过程发生在所有含线粒体的细胞中，以及似乎随着年龄的增长而进一步增强（德赛等人1996）。在更深一层的步骤中，生成的超氧阴离子.O2-可以通过铁催化的反应转换成.OH。在文献中，关于线粒体中的总电子通量的估计显示出，通过电子漏并导致.O2-形成程度存在1％至5％之间（(哈利韦尔1998）。因此，可以认为，线粒体电子传递链是量化活性氧形成的最重要的机制。黄嘌呤氧化酶主要位于血管内皮细胞，能催化次黄嘌呤转化成黄嘌呤，进而生成尿酸。黄嘌呤氧化酶通常以脱氢酶的形式存在体内（XD黄嘌呤脱氢酶），它利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）作为电子受体，形成极大量的活性氧（罗伊和麦科德1983）。通过激活钙依赖性蛋白酶巯基氧化或蛋白水解能导致黄嘌呤脱氢酶转换成黄嘌呤氧化酶，其中后者在催化作用中利分子氧形成超氧自由基（Parks和Granger1986）。这种活性氧的生成过程已经在代谢性应激下被研究，在细胞缺氧复氧损伤中起着特殊的作用（Granger1988）。此外，缺氧或局部缺血与磷酸腺苷（AMP）的积累相关联，是由于受损三磷酸腺苷（ATP）再合成的结果。磷酸腺苷（AMP）进一步转化为肌苷酸（IMP），导致次黄嘌呤的水平增加，这是黄嘌呤氧化酶的主要底物。游离铁已被证明能催化活性氧的生成。一个著名的的铁催化生成活性氧的机制是芬顿反应，其将过氧化氢（H2O2）转换成更多的羟基自由基（芬顿1894）。通过还原Fe3+为Fe2+，超氧阴离子.O2—可以增加铁离子对芬顿反应的的有效性（哈利韦尔1998）。铜也有与H2O2形成反应生成OH—的潜力（Haber和Weiss1943）。此外，电子转移到过氧化物和氢过氧化物可以通过铁和铜离子送达，并导致活性氧的生成。花生四烯酸作为前列腺素和白三烯途径的前体起着重要的作用。前列腺素通过环氧合酶形成，进而，前列腺素的生物合成伴随着活性氧的产生。同样，通过脂氧合酶转换花生四烯酸为白三烯，已被确定为是活性氧的一个来源（Losetal.1995）。然而，在形成活性氧时的花生四烯酸代谢的潜在作用尚未明确。氮为中心的活性物质及其衍生物一氧化氮（NO）是通过三种不同的一氧化氮合成酶（NOS）将L-精氨酸转化为L-瓜氨酸而来。一氧化氮合酶已被分为有神经型（nNOS或NOS1）、内皮型（eNOS或NOS3）和诱导型（iNOS的或NOS2），其中后者主要是在免疫系统中。然而，许多组织中表达一个以上的这些亚型。虽然三种一氧化氮合酶亚型催化相同的反应，但他们的调节、优先表达部位、以及一氧化氮合成的量和持续时间上有所不同（表9.1）（Lincoln等人1997年）。神经型一氧化氮合酶和内皮型一氧化氮合酶表现出组成型表达，并且预成型蛋白获得活性时钙离子内流以及结合钙调蛋白。血管通过内皮型一氧化氮合酶形成一氧化氮，是直接通过增加血液流动和剪切力来促进的（Cooke等人，1991）。由于损伤或肌肉机械活动，神经型一氧化氮合酶蛋白表达增加，而神经损伤后它的表达会降低（斯塔姆勒和迈斯纳2001）。神经型一氧化氮合酶和内皮型一氧化氮合酶产生低水平的一氧化氮活化，不超过微微摩尔。相比之下，诱导型一氧化氮合酶的活性不依赖于细胞内钙离子，主要由信号转导通路转录水平进行调控，涉及核因子-kB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、蛋白激酶C、和低氧诱导因子-1（HIF-1）（波格丹2001；温格2000）。一旦表达，诱导型一氧化氮合酶生成一氧化氮的含量很高，这一过程可以持续几个小时甚至几天。免疫活性细胞在刺激过程中，中性粒细胞和巨噬细胞可以通过激活吞噬细胞亚型的NADPH氧化酶产生大量的超氧化物及其活性衍生物（博格达等人，2000）。此外，NADPH氧化酶也存在于嗜酸性粒细胞中，可以诱导活性氧的形成（Lindsay和Giembycz1997）。活性氧在免疫活性细胞中的形成是一系列酶控制和非酶促反应（图9.1）。在中性粒细胞中，氧分子起初通过NADPH氧化酶还原成超氧阴离子.O2—。在接下来的步骤中，通过超氧化物歧化酶发生超氧化物歧化产生的H2O2。过氧化氢通过髓过氧化物酶（MPO）的催化进一步转化为次氯酸（HOCI）。次氯酸是最强的氧化杀菌剂，也是呼吸爆发的酶级联反应中的最终产物（Weiss1989）。刺激中性粒细胞和单核/巨噬细胞产生活性氧受复杂的调控机制的影响。脂多糖（LPS）和多种细胞因子或趋化因子是重要的活化剂和吞噬细胞NADPH氧化酶调节剂。白细胞介素8有着特殊的作用，因为它不仅能诱导形成活性氧，也有许多其它生物学特性，如对细胞迁移和粘附分子表达的诱导（Baggiolini等人1995）。证据表明，在中性粒细胞和单核细胞中，氧化爆裂的细胞内信号传导部分取决于游离钙离子（Ca2+）的增加。多种免疫活性细胞在炎性刺激下，如细胞因子和内毒素刺激，可引起诱导型一氧化氮合酶的表达。缺氧、高温和低浓度.NO本身，是非炎症性诱导型一氧化氮合酶的诱导剂。与此相反，皮质醇和更高水平的.NO将发挥抑制作用。在这样的背景下，后者的机制似乎反映出是预防.NO过量生成的重要的反馈机制。需要重视的是，在某些条件下，一些非免疫细胞，例如肝细胞、上皮细胞、心脏和骨骼肌细胞也能够引起诱导型一氧化氮合酶表达（林肯等人1997；斯塔姆勒和迈斯纳2001）。活性氧和活性氮的作用机制大多数的活性氧和活性氮的直接化学作用被局限于它们产生的附近的位置，并且由它们的反应性和合适的反应伙伴的可利用性来确定。活性氧和氮物种的特性，产生一种强大的破坏作用，它是对脂质、蛋白质、核酸、以及细胞外基质产生破坏性影响的基础（哈利韦尔1998）。另一方面，活性氧和氮的物种，如在严格控制的条件下可中等水平（适度）的生成，在各种信号传导过程中承担起调节介质的的作用（Droge2002），并实现重要的生理功能。生物系统中的氧化应激要维持细胞的氧化还原平衡，活性氧的生成率和抗氧化系统能力之间需要平衡。目前的范式提出了，细胞的氧化还原平衡主要是受氧化还原敏感的信号转导机制调节，通过诱导清除系统对增强活性氧的形成作出反应。然而，如果活性氧的产生过多或快速，系统可能无法充分反应。反过来，细胞的氧化还原状态转向更加促氧化状态，与增强脂质、蛋白质和核酸的氧化修饰作为一个结果（哈利韦尔1998）。脂质过氧化非酶促脂质过氧化过程的初始步骤是通过氢从活性氧的多不饱和脂肪酸（PUFA）侧链的提取来反映。反过来，产生脂质自由基和氧是在这个自由基链反应的中间和传播步骤所必需的。金属离子分解脂质过氧化物，增加可用的过氧化氢和烷氧自由基，从而提取氢和开始新的过氧化周期（哈利韦尔1998）。脂质过氧化过程中的脂质过氧化物的积累，对细胞膜会产生破坏影响。这种情况会干扰细胞的完整性，并进一步导致活性氧介导的反应。过氧自由基不仅能够从多不饱和脂肪酸中除去氢，也能从核酸和氨基酸中除去氢，说明脂质过氧化过程中DNA和膜蛋白的氧化修饰的发生。蛋白质氧化活性氧的作用包括在氨基酸残基（如精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸）中的各种氧化修饰（Stadtman2001）。蛋白质的氧化修饰的主要途径包括初始.OH-诱导提取氢从氨基酸残基形成碳中心自由基。进一步反应导致烷基、过氧化氢和烷氧自由基的形成，而这也可能从氨基酸残基中提取氢。氧化蛋白质损伤研究中最常用的标记是活性羰基衍生物（RCD）。修饰的蛋白质会影响其生理功能和加速蛋白水解降解，这可利用谷氨酰胺合成酶为例进行证明（莱文1983）。像甘油醛磷酸脱氢酶或线粒体ATP合成酶的抑制，是通过活性氧经巯基氧化而引起的，如过氧化氢（科克伦1992）。基于标记物如活性羰基衍生物，氧化蛋白的积累已是公认的逐渐发生在老化的过程中，并且与一系列疾病的严重程度相关（Stadtman2001）。有趣的是，氧化损伤的蛋白质发挥清除作用，这已被证明比那些观察DNA氧化损伤DNA已被认为是氧化损伤最显著的生物标记。关于DNA损伤速率的估计表明，每个人体细胞平均每天至少发生几百个DNA氧化损伤（Loft和Poulsen1999）。有进一步的报道，线粒体DNA（mtDNA）氧化损伤的量比核DNA（nDNA）有更高的稳定状态