各种酶活性测定方法

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX是植物体内重要的抗氧化酶,主要功能是分解H2O2,此过程通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环来完成。此外,它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢,而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20℃下浸提30min，中间摇动数次，3000r/min离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2mL，20℃下反应10min后，立即加入偏磷酸1mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX的活性。每个处理设3个重复。（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH7.8）提取液（含1mmol·L-1AsA，3mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5mmol·L-1PMSF，2%PVP，1mMEDTA）。用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20min，上清液用于酶活性的测定。取0.10ml酶液（可视情况调整），加入1.70ml含0.1mMEDTA-Na2的PBS（0.05mol/L，pH7.0），再加入0.10ml5mM的AsA，最后加入0.10ml20mMH2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。APX总活性(uM·g-1·min-1)=△OD×Vr/(A×d×Vt×W×△t)△OD：反应时间内吸光度的变化；△t：反应时间，min；Vr：提取液体积，mL；A：消光系数，2.8mM-1﹒cm-1；d：比色杯厚度，1cm；Vt：测定液体积，mL；W：样品鲜重，g。二、过氧化氢酶（CAT）活性测定1.原理过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白，含有铁，能够催化过氧化氢分解为水和氧分子，此过程中起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂，因此可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。2.CAT活性测定方法碘化钾滴定法：本方法利用H2O2能将KI中的I-氧化，生成I2，以淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成I2的量，再换算所消耗H2O2的量。取100ml三角瓶6个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10ml立即向4、5、6号瓶中各加入3.6ml/L硫酸5ml以终止反应。作为空白测定然后将各瓶放在20错误!未找到引用源。水浴中保温，待瓶内温度达到20错误!未找到引用源。时，并向各瓶准确加入5ml0.1mol/LH2O2摇匀，记录时间。5min后再依次向1、2、3号瓶中各加入3.6mol/L硫酸5ml终止酶促反应，然后向每瓶各加20%碘化钾1ml，3滴钼酸铵及5滴淀粉指示剂。用0.02mol/L硫代硫酸钠滴定至蓝色消失过氧化氢酶活性=错误!未找到引用源。A：空白值滴定值（ml）B：样品滴定值（ml）C：Na2S2O2浓度（mmol/L）a：测定时酶液用量（ml）V：酶液总体积W：样品重（g）t：反应时间（min）17:1/2H2O2的摩尔质量（mg）2.紫外吸收法：H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。测量吸光率的变化即可测出过氧化氢酶的活性。试管号S1S2S3提取液（ml）0.40.40.4失活酶液缓冲液（ml）3.03.03.0蒸馏水（ml）2.02.02.025℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，计算。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。过氧化氢酶活性[u/(g×min)]=A240×VT/(0.1V1×t×W)。其中A240=AS3-(AS1-AS2)/2；AS1、AS2样品管吸光值；AS3加入失活酶液的对照管吸光值；VT粗酶提取液总体积(ml)；V1测定用粗酶液体积(ml)；W样品鲜重(g)；0.1是A240每下降0.1为1个酶活单位(u)；t加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。三、过氧化物酶（POD）测定方法1.原理过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量．2.POD活性测定方法比色法：称取植物材料1g，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000r／min离心10min，上清液转入100mL容量瓶中，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。2、取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1只中加入反应混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470nm下吸光度值，每隔1min读数一次。3、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min·g（鲜重）]表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）表示。过氧化物酶活性[u/（g·min）ΔA470为反应时间内吸光值的变化；W为所称样品重，g；t为反应时间，min；VT为提取酶液总体积，ml；VS为测定时取用酶液体积，ml。四、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000r/min离心20min，上清液即为酶液。2、酶活性测定（1）反应混合液配制：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μlPBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。SOD总活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。