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基金项目：湖北省卫生厅资助课题（编号：鄂卫发２００８Ｙ１８）作者单位：１４３００２２武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院骨代谢实验室；２４３２２００武汉，武汉市黄陂人民医院骨科通讯作者：沈霖，Ｅｍａｉｌ：ｓｈｅｎｌｉｎｈｂ＠．ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎＤＯＩ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ１６７４２５９１２００９０１００６·基础研究·活性维生素Ｄ３对去卵巢骨质疏松大鼠骨质量、维生素Ｄ代谢物水平及肾脏维生素Ｄ受体（ＶＤＲ）ｍＲＮＡ表达的影响王介毅１，２，沈霖１，帅波１，杨艳萍１，郭向飞１，曹晴晴１，魏兵１［摘要］ 目的 研究活性维生素Ｄ３对去卵巢骨质疏松大鼠骨质量２５（ＯＨ）Ｄ３和１，２５（ＯＨ）２Ｄ３水平及肾脏ＶＤＲｍＲＮＡ表达的影响，为临床防治骨质疏松提供依据。方法 ３６只八月龄健康雌性ＳＤ大鼠随机分为３组，即模型组（Ｍｏｄｅｌ），假手术组（Ｓｈａｍ），活性维生素Ｄ３治疗组（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ），每组１２只，对照治疗三月后全部处死，用双能Ｘ线骨密度仪及生物力学技术评估模型的骨密度及骨质量，采用酶联免疫吸附方法检测血清或组织中２５（ＯＨ）Ｄ３和１，２５（ＯＨ）２Ｄ３含量，用ＦＱＰＣＲ方法检测肾脏组织中ＶＤＲｍＲＮＡ的表达情况。结果 （１）模型大鼠股骨头及粗隆部的ＢＭＤ及骨生物力学指标（最大载荷和最大压应变）均明显下降（Ｐ＜００５）；（２）活性维生素Ｄ３治疗组与模型组比较，血清、肝脏和肾脏组织中２５（ＯＨ）Ｄ３和１，２５（ＯＨ）２Ｄ３的含量明显提高（Ｐ＜００５），与假手术组比较无统计学意义；（３）模型组大鼠肾脏ＶＤＲｍＲＮＡ的表达显著低于活性维生素Ｄ３治疗组（Ｐ＝０００４）。结论 本实验结果提示适当补充活性维生素Ｄ３可有效的防治去卵巢大鼠骨量丢失和骨质量下降，为临床活性维生素Ｄ应用提供实验依据。［关键词］ 维生素Ｄ受体；骨密度；骨生物力学；骨质疏松症；１，２５（ＯＨ）２Ｄ３中图分类号：９１；Ｒ６８１ 文献标识码：ＡＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆａｌｆａｃａｌｃｉｄｏｌｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｂｏｎｅｑｕａｌｉｔｙ，ｖｉｔａｍｉｎＤｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｎｄｒｅｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｖｉｔａｍｉｎＤｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＤＲ）ｍＲＮＡｉｎｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄｒａｔｓＷＡＮＧＪｉｅｙｉ，ＳＨＥＮＬｉｎ，ＳＨＵＡＩＢｏ，ｅｔａｌ（ＵｎｉｏｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＴｏｎｇｊｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００２２，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆａｌｆａｃａｌｃｉｄｏｌｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｔｗｏｂｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｍａｋｅｒｓ，２５ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤａｎｄ１，２５ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ３，ａｎｄｒｅｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＤＲｍＲＮＡｉｎｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄｒａｔｓ，ａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｖｉｔａｍｉｎＤｅｎｄｏｃｒｉｎｅｓｙｓｔｅｍｉｎｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄｒａｔｓ，ｔｈｅｎｔｏｆｉｎｄｏｕｔａｃｏｓｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｔｏｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｔｒｅａｔｏｆｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６ｆｅｍａｌｅＳＤｒａｔｓ（ｅｉｇｈｔｍｏｎｔｈｓ）ｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｓｈａｍｇｒｏｕｐａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ．Ａｌｌｒａｔｓｗｅｒｅｋｉｌｌｅｄｔｈｒｅｅｍｏｎｔｈｓｌａｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｎｄｕａｌｅｎｅｒｇｙＸｒａｙａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ（ＤＸＡ）ａｎｄｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓｔｅｓｔｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅＢＭＤａｎｄｂｏｎｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｔｈｅｍｏｄｅｌ．ＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆ２５ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤａｎｄ１，２５ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ３ｉｎｓｅｒｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅ．Ｗｈｉｌｅ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ（ＦＱＰＣＲ）ｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｎａｌＶＤＲｍＲＮＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅＢＭＤ，ｉｎｄｅｘｏｆｍａｘｉｍａｌｌｏａｄａｎｄｍａｘｉｍａｌｓｔｒｅｓｓｏｆｆｅｍｏｒａｌｈｅａｄｏｒｔｒｏｃｈａｎｔｅｒｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｍｏｄｅｌｒａｔｓ（Ｐ＜００５），ｗｈｉｌｅ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆ２５ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤａｎｄ１，２５ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ３ｄｉｓｃｅｒｎｉｎｓｅｒｕｍ，·６３·中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 ２００９年３月第２卷第１期ＣＨＩＮＪＯＳＴＥＯＰＯＲＯＳＩＳＢＯＮＥＭＩＮＥＲＲＥＳ Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．１ Ｍａｒｃｈ２０，２００９ｌｉｖｅｒａｎｄｋｉｄｎｅｙｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ（Ｐ＜００５）．Ｂｕｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｈａｍｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＤＲｍＲＮＡｈａｄａｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐａｎｄｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＝０００４）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｓｈｏｗｓｔｈａｔａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅａｍｏｕｎｔｏｆａｌｆａｃａｌｃｉｄｏｌｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｂｏｎｅｌｏｓｓａｎｄｂｏｎｅｑｕｌｉｔｙｄｅｃｒｅａｓｅｉｎｏｖａｒｅｃｔｏｍｉｚｅｄｒａｔｓａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＶＤＲ；ＢＭＤ；ｂｏｎｅｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ；ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ；１，２５ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ３ 维生素Ｄ内分泌系统在骨代谢调节中起着重要的作用，１，２５（ＯＨ）２Ｄ３是重要的骨代谢调节激素（Ｄ激素），１，２５（ＯＨ）２Ｄ３水平不足是老年人骨量丢失、骨基质矿化不良等骨代谢改变的重要启动因素之一。本实验研究去卵巢骨质疏松大鼠体内维生素Ｄ内分泌系统的代谢情况，探讨其可能的发病机制，并寻求一条经济有效的防治措施。材料和方法材料实验动物 ８月龄健康雌性ＳｐｒａｎｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠（二级，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，动物合格证号：医动字２０－１３７），３６只，平均体重４１０±１０ｇ。使用的仪器及材料 美国生产的Ｈｏｌｏｇｉｃ２０００Ｐｌｕｓ型双能Ｘ线骨密度仪，日本岛津生产的ＡＵＴＯＧＲＡＰＨ（ＡＧＳＨ１０ＫＮ）型生物力学测定仪，德国Ｒｏｃｈｅ公司生产的ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ荧光定量ＰＣＲ仪，英国ＩＤＳ公司２５（ＯＨ）Ｄ３及１，２５（ＯＨ）２Ｄ３酶联免疫试剂盒，美国ＧＩＢＣＯ公司的Ｔｒｉｚｏｌ溶液；美国Ｂｉｏｔｉｕｍ公司的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光染料；武汉大风生物科技有限公司的ＰＲＯＭＥＧＡ；上海枫岭生物技术有限公司的ＦＴＣ２０００；昆明贝克诺顿制药工业有限公司分装的活性维生素Ｄ３［１，２５（ＯＨ）２Ｄ３］。分组及材料的准备实验分组 ＳＤ大鼠３６只，随机分为３组，分别为模型组（Ｍｏｄｅｌ），假手术组（Ｓｈａｍ），活性维生素Ｄ３治疗组（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ），每组１２只。模型制备及喂养取材 模型组和活性维生素Ｄ３治疗组的大鼠将卵巢摘除，假手术组仅切除卵巢附近的相当于卵巢大小的一小部分脂肪。药液配置与给药方法：活性维生素Ｄ３先用少量无水乙醇溶解，再用双蒸水配置成０６２５μｇ／１００ｍｌ溶液，乙醇终浓度为０４％，对试验大鼠生理无影响，溶液配置好后分装小试剂瓶内避光低温保存。按人鼠表面积比率换算等效计量法计算出治疗组大鼠每次用配制好的活性维生素Ｄ３溶液９ｍｌ（００５６２５μｇ）／ｋｇ，每日两次灌胃，其余组给予等体积的不含活性维生素Ｄ３的０４％乙醇灌胃，灌胃次数同活性维生素Ｄ３治疗组。对照治疗３月后，将３６只大鼠心脏取血，离心分离出血清，取肝、肾等同一部位一小部分组织于冻存管中－７０℃保存，取右侧大鼠股骨，小心剥离去除表面软组织，保留完整骨膜，冷生理盐水纱布冷藏保存。各观察指标检测方法骨密度的检测 取股骨样品，置双能Ｘ线骨密度仪扫描台上，采用美国生产的Ｈｏｌｏｇｉｃ２０００Ｐｌｕｓ型双能Ｘ线骨密度仪，测量大鼠股骨头及粗隆部ＢＭＤ。各股骨在测定时保持统一位置，测定程序及条件按ｓｍａｌｌａｎｉｍａｌｓｏｆｔｓｃａｎｓ进行，分析程序按Ｓｕｂｒｅｇｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｃａｎｓ进行。结果由仪器配套打印机自动打印输出。骨生物力学的检测 取股骨样品，应用日本岛津生产的ＡＵＴＯＧＲＡＰＨ（ＡＧＳＨ１０ＫＮ）型生物力学测定仪进行三点弯曲试验，试验时参数：最大载荷２０ｋｇ，跨距２２ｃｍ，加载速度５ｍｍ／ｍｉｎ，增益１００，并计算出最大载荷（ＭＬ）和最大压应变（ＭＳ）。２５（ＯＨ）Ｄ３和１，２５（ＯＨ）２Ｄ３含量的测定 将肝、肾等组织室温复融后用生理盐水洗净去杂、称重、剪碎至１０ｍｌ的组织匀浆器中，按１ｇ组织加入５ｍｌＰＢＳ缓冲液的比例进行组织匀浆，将组织匀浆液移入５ｍｌ离心管中２０℃４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清后再１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后取上清备用。检测操作过程严格按照试剂盒说明书进行。组织总ＲＮＡ的提取 用滤纸吸干肾脏表面液体，将肾脏（约２００ｍｇ）置于盛有液氮的研钵内，快速研成粉末状；迅速将粉末移入匀浆器，加入·７３·中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 ２００９年３月第２卷第１期ＣＨＩＮＪＯＳＴＥＯＰＯＲＯＳＩＳＢＯＮＥＭＩＮＥＲＲＥＳ Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．１ Ｍａｒｃｈ２０，２００９Ｔｒｉｚｏｌ（１００ｍｇ肾脏＋２ｍｌＴｒｉｚｏｌ），冷冻匀浆，将匀浆后液体分装入ＥＰ管内，１５～３０℃孵育５ｍｉｎ，加入氯仿（０２ｍｌ氯仿１ｍｌＴｒｉｚｏｌ），盖紧盖子，用力摇动１５ｓ，１５～３０℃孵育２～３ｍｉｎ，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液至新ＥＰ管内；加７５％乙醇沉淀，加ＤＥＰＣ处理水溶解ＲＮＡ。ＶＤＲｍＲＮＡ的测定 引物设计：引物由上海赛百胜公司依据Ｇｅｎｅｂａｎｋ数据库获得基因序列合成。ＶＤＲ引物：上游ＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＡＣＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴ，下游ＡＡＧＡＣＴＧＧＴＴＧＧＡＧＣＧＴＡＡＣＡＴＧＡ；βＡｃｔｉｎ引物：上游ＡＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＣＴＧ，下游ＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡ。在逆转录酶ＭＭＬＶ的作用下，将ｍＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ分子，反应体系如下：Ｈ２Ｏ５５μｌ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ１８）１０μｌ、ＴＲＮＡ６０μｌ、ＲＮａｓｉｎ０５μｌ、５×ｂｕｆｆｅｒ４０μｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２０μｌ、ＲＴａｓｅ１０μｌ，反应条件：４２℃６０ｍｉｎ，９５℃５ｍｉｎ。荧光定量ＰＣＲ反应体系如下：ｃＤＮＡ１μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ１０×５μｌ、ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）７μｌ、ｄＮＴＰ１０ｍｍｏｌ／Ｌ１μｌ、Ｆ（２０ｐｍｏｌ／ｌ）０８μｌ、Ｒ（２０ｐｍｏｌ／ｌ）０８μｌ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ１μｌ、Ｔａｑ酶（５Ｕ／μｌ）０５μｌ，Ｈ２Ｏ３２９μｌ，反应条件：９４℃３ｍｉｎ，（９４℃３０ｓ，５３℃３０ｓ，７２℃３０ｓ）５０个循环。Ｃｔ值的计算分析：２－ΔΔｃｔ＝２－（Δｃｔ实验组－ΔＣｔ对照组）ΔＣｔ实验组＝ΔＣｔ目的基因－Ｃｔβａｃｔｉｎ，ΔＣｔ对照组＝ΔＣｔ目的基因－Ｃｔβａｃｔｉｎ，统计方法统计学方法